实验目的

1.掌握秀丽隐杆线虫的培养和保存方法。

2.观察线虫胚后发育过程。

实验原理

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）是一种可以独立生存的线虫，隶属于线形动物门，线虫纲，小杆线虫目，广杆线虫属，又称作秀丽新小杆线虫或简称秀丽线虫。成虫长约1 mm，有性别的分化：雄虫和雌雄同体虫，性发育成熟的同体虫卵细胞既可以接受自体的精子（自交）也可以接受雄虫的精子（杂交）。一个野生型同体虫可以产出近300粒卵，受精卵孵化出小虫，经过三次蜕皮的胚胎后发育成为成虫。在20℃培养条件下，线虫整个发育周期历经3.5 d（附图3-1）。

附图3-1　线虫生活史

秀丽隐杆线虫是常用的实验模式生物，其具有生命周期短、容易培养和保存、分子遗传操作简便易行等优势，为发育生物学研究开辟了广阔的前景。许多重大的生物学基本问题，如细胞凋亡（apoptosis）、RNA干扰（RNA interference）和小RNA（miRNA）的发现都是以线虫作为模式生物的。本实验是让学生了解线虫培养、保存、发育时序观察等基本实验操作，为线虫遗传和分子生物学操作奠定基础。

实验用品

1.材料

成年早期（young adult stage）线虫（包括雌雄同体虫和雄虫）。

2.器材

普通体式解剖镜、铂针、线虫培养板、20℃培养箱。

3.试剂

（1）线虫培养基配方：NaCl 3 g，琼脂10～20 g，蛋白胨2.5 g，加975 mL蒸馏水，高压蒸汽灭菌后加再入下列无菌溶液（1 mol/L CaCl2 1 mL；1 mol/L MgSO4 1 mL；1 mol/L K3PO4 25 mL；胆固醇5 mg/mL，用无水乙醇溶解），混匀。

（2）大肠杆菌OP50菌悬液：用无菌枪头挑一点-80℃保存的菌接种到2 mL液体LB中，37℃过夜摇菌。然后在500 mL液体LB中滴加500 μL OP50菌悬液，37℃放置24 h，取出放4℃，需要加菌时拿出用即可，用后再放入4℃。

（3）液体LB配方：NaCl 10 g，yeast extract 5 g，bacto-tryptone 10 g，加蒸馏水定容到1 L，调pH至7.0，高压蒸汽灭菌后使用。

实验程序

1.线虫冰冻复苏

此步骤可在实验课前3～5 d准备。冰冻的线虫可在-80℃无限期保存，需要复苏时取出冻存管，常温放置待冻存液融化，吸取悬液到线虫培养板一端，20℃培养箱中培养，2～3 d后挑取活的线虫入新板传代。

2.线虫培养(www.daowen.com)

在隔夜倒好的线虫培养板（内含线虫培养基）上，用滴管接种大肠杆菌OP50菌悬液于表面，常温培养过夜，待长出一层细菌后，在体视显微镜下用经火焰灼烧灭菌的铂金丝挑取线虫放在平板上，在20～25℃之间培养。

3.线虫同体虫和雄虫辨别

同体虫和雄虫在体视镜下容易区分，雄虫较细长且尾部有扇状交配器，同体虫有产卵器且成年后肚里有卵（附图3-2）。

附图3-2　线虫模式附图

A.雌雄同体虫B.雄虫（来自http：//www.wormatlas.org/）

4.在培养板上培养线虫并在体视镜下连续观察线虫胚胎后发育过程。挑一只成年线虫（肚中可见卵）于平板上，20℃培养，待其产卵，之后每隔约10 h观察1次。线虫孵出后经历4次蜕皮，经过L1-L2-L3-L4时期进入成年期（adult），不同时期除了体长变化外，进入L4时期的线虫将来产卵器附近会出现月牙状白斑，这是L4时期线虫标志。

实验注意事项

1.胆固醇不可加热，可过滤除菌。

2.挑取线虫时手用力要轻，不要将琼脂板表面划破，以免虫子钻入其内影响观察。

3.雌雄同体虫自交后代中雄虫比例极少，但同体虫与雄虫交配后代中雄虫比例近50%，所以可以用雌雄同体虫与雄虫交配后冷冻保存盘上线虫，这样恢复过来就会得到较多的雄虫。

4.由于线虫产卵有先后，所以同一时间段中盘上会有不同时期的线虫，可以训练学生对比不同时期线虫形态差异。

思考题与作业

1.请绘出不同时期线虫发育进程附图。

2.查找文献解答如下问题：线虫的性别决定方式和哺乳动物一样吗，为什么雌雄同体自交产生后代中仅有约千分之一的雄虫？

3.请谈一谈线虫作为实验用模式生物具有哪些优点与缺点。

参考文献

王盛献.推荐一种遗传学教学用新材料——秀丽隐杆线虫[J].遗传,1989,11(2)：36-39.Hope I A.C.elegans：a practical approach[M].London：Oxford university Press，1999.

（李凯，李巧峡）