实验目的
1.通过实验，进一步掌握动物受精的过程，了解不同动物所属的不同受精类型。
2.掌握受精卵的切片制作过程。
实验原理
不同的动物根据其卵子发育的时期，在受精前大致可分为四种情况：①处于初级卵母细胞，精子进入后才完成二次成熟分裂，如：蛔虫、沙参等；②受精在第一次成熟分裂的中期，如：贻贝、蛤等；③受精在第二次成熟分裂的中期，如：绝大多数脊椎动物、文昌鱼等；④受精发生二次成熟分裂之后，如：海胆。精卵接触并进入卵内大致可分为三个阶段：①顶体反应：绝大多数的卵子都有卵膜，只有少数是裸卵，因此，在受精时精子必须先穿过卵膜。所以，精卵接触时首先会发生顶体反应，即精子的顶体产生一系列的变化，顶体释放出一些酶，溶解精卵接触处周围的卵膜、质膜，使二者质膜发生融合，随之精子头部的内含物被拖入卵细胞质内。②雌雄原核的形成：精子入卵后，自己的核膜发生破裂，并分散于卵细胞质内，其中的染色质也从致密状态松散成为细丝状，然后泡状核膜重新组装，形成雄原核。卵子的核在二次成熟分裂后形成雌原核。③雌雄原核融合：雄原核同精虫星光一起通过卵细胞质朝向雌原核处前进，最后二者融合，形成受精卵。
经典的马蛔虫受精过程为：未受精卵：卵呈圆形，有丰富的卵黄，明区为卵核（箭头），核内有着色很深的圆球形的核仁；精子入卵：锲型的精子（箭头）已钻入卵内，引起卵的第一次成熟分裂，卵核膜溶解，染色体已出现，由于激动引起卵的凹凸不平，整个卵球已不呈圆形；第一次成熟分裂：第一次成熟分裂图形已建成，六条染色体排列在纺锤体的中腰，精子头膨大（箭头），已移入卵子中央，卵黄膜加厚形成受精膜；第二次成熟分裂：第一极体外排（箭头），第二成熟分裂中期的图形已建成，精子膨大形成原核，卵周隙出现，已移入卵子中央，卵黄膜加厚形成受精膜；雌、雄原核相结：雌、雄原核均已形成，并已移近相结合（箭头示）；受精过程即告结束；第一次卵裂：受精卵第一次卵裂的图形已建成。中心粒位于纺锤体的两极，染色体排列在纺锤体的中腰；第一次卵裂：图为首先卵裂中期的极面观，图示清晰可辨的六条染色体；第二次卵裂：马蛔虫属不规则卵裂，上面的两个细胞进行左右裂，下面的两个细胞进行上、下裂（见附图2-1）。
实验用品
1.材料
性成熟的雌草鱼和雄草鱼，性成熟的雌蟾蜍和雄蟾蜍。
2.仪器
培养皿，表面皿，注射器，鱼缸，搪瓷盘，镊子，手术剪刀，吸管；染缸，载玻片，盖玻片，手摇切片机，组织包埋机，展台，普通光学显微镜。
3.试剂
（1）Bataillon固定液：铬酸（10%水溶液）25 mL，苦味酸（饱和水溶液）100 mL，冰醋酸10 mL。最好在使用前配制，20℃左右方有效，否则必有沉淀出现，不宜使用。每6 mL固定液固定10个受精卵。
附图2-1 马蛔虫受精过程
A.未受精卵；B.精子入卵；C.第一次成熟分裂；D.第二次成熟分裂；E.雌雄原核相结；F.第一次卵裂；G.第一次卵裂；H.第二次卵裂
（2）促黄体生成素释放激素类似物（LRH-A），马来酸地欧酮（DOM）催产激素。
（4）番红水溶液：番红1.5 g，苯胺水饱和液100 mL。溶液过滤后使用。
（5）2%固绿染色液：固绿2 g，95%乙醇100 mL。
（6）碘酒：70%乙醇500 mL，1 g碘。
实验程序
1.蟾蜍受精过程
（1）取材固定：蟾蜍的人工受精见实验二十，收集未受精卵和受精后25 min、35 min、65 min、80 min、140 min的受精卵；用Bataillon固定液固定24 h，然后流水冲洗24 h，至苦味酸褪色为止；置于碘酒中数小时或24 h，中间碘酒换数次至碘酒不褪色为止；置于70%乙醇5 min；于80%乙醇中保存。
流水冲洗后，若卵胶膜未完全溶解，可用饱和次氯酸钠溶液3 mL处理1～2 min，即可溶解20～30粒卵胶膜，振荡溶解后水洗，置于70%乙醇5 min，后用80%乙醇中保存。
（2）脱水、透明与包埋：受精后不同时间的受精卵置于80%乙醇（5 min），95%乙醇（5 min），100%乙醇（3 min）；1/2无水乙醇+1/2氯仿（5 min），100%氯仿（20～40 min）；1/2氯仿+1/2石蜡（30℃以上，3～4 h），纯石蜡（15 min）；石蜡包埋。
（3）切片：于手摇切片机上切片，切片厚度为7～10 μm。
（4）染色：脱蜡：二甲苯（10 min），1/2二甲苯+1/2无数乙醇（3～5 min）；复水：无水乙醇（3～5 min），95%乙醇（95%乙醇∶福尔马林=2∶1,3～5 min），80%乙醇（3～5 min）；70%乙醇（3～5 min），50%乙醇（3～5 min），30%乙醇（3～5 min），蒸馏水；染色：加番红溶液于载玻片材料上，热染，即将载玻片在乙醇灯火焰上徐徐掠过，不时摇动（3 min）；清水洗涤；复染：固绿溶液中对染（5～10 s）；脱水：立即投入95%乙醇中摆洗数次，无水乙醇（4 s），无水乙醇（10 min）；透明：二甲苯（5 min），二甲苯（5 min）；封片：滴树胶，盖盖玻片。
（5）实验观察（附图2-2）。
附图2-2-A.未受精卵：卵核处于第一次成熟分裂中期，箭头示为纺锤体，纺锤体中腰的染色体多呈飞鸟形和十字形。（×20）
附图2-2-B.未受精卵：卵核处于第二次成熟分裂中期，箭头示为排列在赤道板上的染色体。（×40）
附图2-2-C.受精25 min：精子由动物极处正在进入卵内，受番红染成老红色（箭头所示）。（×40）
附图2-2-D.受精35 min：精子入卵后，引起卵核由第二次成熟分裂中期进一步发展到末期，箭头所示为卵核第二次成熟分裂末期的图形。（×40）
附图2-2-E.受精65 min：雄原核形成，移入卵内清亮区。（×20）(www.daowen.com)
附图2-2-F.受精80 min：雌原核已完全形成，并移向卵子深部（箭头所示）。周围不具清亮区，核体较大，内含染色质。（×40）
附图2-2-G.受精140 min：融合核已完全形成，分裂星光发展伸长，将要形成首次卵裂纺锤体的图形。染色体形成。（×40）
附图2-2 蟾蜍受精过程
A.未受精卵；B.未受精卵；C.受精25 min；D.受精35 min；E.受精65 min；F.受精80 min；G.受精140 min
2.草鱼受精过程
（1）人工催产：将性成熟的雌草鱼进行人工催产，催产激素为（LRH-A）和（DOM），注射剂量为每尾注射LRH-A 10 μg+DOM 10 μg+0.5 mL生理盐水，注射部位为雌鱼的腹腔。催产后，经16～20 h，雌鱼腹部明显增大而且变得很松软，雌鱼即将产卵。此时轻压雌鱼腹部，从生殖孔流出的卵子一入水即可散开，表明卵子发育成熟，即可进行人工受精。
（2）人工受精：将雄鱼杀死，取出精巢放入已盛有0.65%生理盐水的表面皿中，用镊子夹碎精巢，释放出精子。将成熟的卵子挤入精液中，轻轻摇晃培养皿使卵子散开，加入适量的已曝气的自来水，2 min后，用清水洗几次，弃去黏液与精巢碎片，人工受精完成。
（3）取材固定：分别取未受精卵与受精后8 min、10 min、15 min、20 min、30 min的受精卵，用Bataillon固定液固定24 h。
（4）冲洗、包埋、切片与染色方法同上。
（5）实验观察（见附图2-3）：
附图2-3 草鱼受精过程
A.未受精卵；B.受精8 min；C.受精8 min；D.受精10 min；E.受精15 min；F.受精20 min；G.受精30 min
附图2-3-A.未受精卵：卵核处于第二次成熟分裂中期。箭头所示为第二次成熟分裂中期纺锤体，纺锤体中腰分布有排列成对的染色体。（×100）
附图2-3-B.受精8 min：精子已进入卵内，伴随精虫星光出现在卵的皮质部，受番红染成老红色（箭头所示）。（×100）
附图2-3-C.受精8 min：精子入卵后，引起卵核立即完成第二次成熟分裂，排出第二极体。卵表外凸物为已外排的第二极体（箭头），极体内的红色粒状物为染色体。（×100）
附图2-3-D.受精10 min：此切面同时可见两个图像。①已外排的第二极体；ON所示为留于卵内的1/2染色体。②SP示伴有精虫星光的精子头。（×40）
附图2-3-E.受精15 min：雄原核正向胚盘深部移动；尚未完全形成的雌原核，呈囊管状，已移近雄原核。（×40）
附图2-3-F.受精20 min：雌原核已完全形成，并与雄原核靠近相结，但二者尚未融合。（×40）
附图2-3-G.受精30 min：分裂星光发展伸长（箭头），首次卵裂图形将建成；合子核内正在由染色质变为染色体，首次卵裂即将开始。（×40）
实验注意事项
1.配制Bataillon固定液时，最好现配现用，必须注意固定液的含量与卵子的比例。
2.流水冲洗后，若卵胶膜未完全溶解，可用饱和次氯酸钠溶液3 mL处理1～2 min，即可溶解20～30粒卵胶膜，振荡溶解后水洗。
3.染色时，固绿中时间要尽量短，10 s左右即可，否则会过染。
思考题与作业
描述马蛔虫、蟾蜍与草鱼三种动物的受精过程，并指出它们之间的异同。
曲漱惠,李嘉泳,黄浙,等.动物胚胎学[M].北京：人民教育出版社,1980.
丁汉波,仝允栩,黄浙.发育生物学[M].北京：高等教育出版社,1987.
司克媛,梁桂霞,俞诗源,等.非洲爪蟾胚胎细胞核移入花背蟾蜍成熟卵后的细胞学研究[J].动物学报,2005,51(5)：924-931.
梁桂霞,陈永龙,刘宏岩.花背蟾蜍♀杂交中华大蟾蜍♂受精过程的细胞学研究[J].遗传,1997,19(2)：17-19.
刘宏岩,梁桂霞,陈永龙.花背蟾蜍受精过程的细胞学研究[J].兰州大学学报：专辑,1997,33：246-249.
（李巧峡，梁桂霞）
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