实验目的

1.掌握精巢与卵巢的切片制作过程。

2.通过切片及活体观察，理解精子和卵子的发生过程，加深对成熟精子形态的认识。

实验原理

卵子发生是在卵巢内进行的，以哺乳动物为例：在性成熟以前，卵巢内有相当数量的卵原细胞，经增殖分裂后数量更多。随着动物性成熟的过程，卵原细胞开始进入生长期即初级卵母细胞。最初，卵母细胞较大，周围为一层扁平的滤泡细胞包围，称为初级滤泡；随着滤泡细胞层数的增多，称为生长滤泡；随着滤泡细胞之间的小腔逐渐汇成一个大腔（滤泡腔），与此同时，初级卵母细胞日趋成熟，积累了各种营养物质，并渐向滤泡腔（充满蛋白质、激素、cAMP和其他分子的混合物）突出，形成卵丘，此即称为次级滤泡或成熟滤泡。然后初级卵母细胞在激素或神经的诱导下从卵巢中排除，并在体腔中完成第一次减数分裂，成为次级卵母细胞。遗留的滤泡细胞发育为黄体（后由卵泡迅速转变成的富有血管的腺体样结构），如卵子不能受精，黄体仅维持2周即萎缩，被结缔组织结疤所代替，形成白体。若卵子受精成功并开始妊娠，黄体继续增长，至妊娠2～3月后慢慢萎缩。

精子形成于精巢，哺乳动物成熟的精子储存于附睾中，取其活体状态下附睾内精液，借助显微镜，即可观察到活体的精子形态。精巢是一结构复杂的器官，在脊椎动物中主要由曲细精管和小的导管所构成，曲细精管是由各个时期的生殖细胞和支持细胞所组成。在高等动物雄性动物性成熟时，由精原细胞产生精子，但精巢内的精原细胞并不是在同一时间突然发育成精子，而是每隔一段时间有周期地有一部分精原细胞发育成为成熟的精子。因此，在同一时间内，在曲细精管的不同部位，即由基膜向管腔排列依次为不同发育时期的精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和分化中的精子。

实验用品

1.材料：小鼠或家兔的精巢、附睾及家兔卵巢。

2.器材：解剖器具，载玻片，盖玻片，吸水纸，酒精灯，染缸，包埋纸盒，手摇切片机，组织包埋机，普通光学显微镜。

3.试剂：乙醇，二甲苯，石蜡。

（1）卡诺氏固定液：95%乙醇∶冰醋酸=3∶1。

（2）1 mol/L盐酸溶液：取82.5 mL密度1.19 g/mL的浓盐酸加蒸馏水至1000 mL。

（3）希夫试剂（Schiff试剂）：称1 g碱性品红于200 mL煮沸的重蒸馏水中，5 min后使其冷却至55～50℃，过滤到一个棕色的试剂瓶中，加入1 mol/L HCl 20 mL，继续冷却至25℃，加入1 g偏亚硫酸氢钠，摇动瓶子使其溶解。密闭瓶口，置黑暗低温处或冰箱内（4℃左右），18～24 h后检查，试剂如透明无色或呈浅黄色时即可使用，这就是Schiff试剂溶液。如有不同程度的红色未褪，可加入1 g活性炭，强烈震荡1 min，仍在低温下静置过夜，然后用滤纸过滤后使用。密封瓶口，包以黑纸，在5℃以下冰箱内可以保存半年。如有白色沉淀，就不能再使用，如颜色变红，可加入少许偏重亚硫酸钠，使之再转为无色，仍可继续使用。

（4）亚硫酸水溶液：取200 mL蒸馏水，加入10 mL 10%偏重亚硫酸钠水溶液和10 mL 1 mol/L HCl，三者使用前混匀。

（5）0.5%固绿乙醇染液：称取0.5 g固绿溶于100 mL 95%乙醇中。

（6）0.9%生理盐水。

（7）Bouin氏固定液：饱和苦味酸50 mL，40%甲醛250 mL，冰醋酸50 mL。饱和苦味酸过滤，甲醛和冰醋酸最好在临用前加入。

（8）1%氨水乙醇溶液：99 mL 70%乙醇中加1 mL氨水。

（9）1%盐酸乙醇溶液：99 mL 70%乙醇中加1 mL盐酸。

（10）1%伊红水溶液：1 g伊红溶于95%乙醇100 mL，充分搅拌完全溶解，用前加2滴冰醋酸。

（11）埃里希氏苏木精：苏木精：1 g；无水乙醇：50 mL；硫酸铝钾：5 g；蒸馏水：50 mL；碘酸钠：0.2 g；冰醋酸：5 mL；甘油：50 mL。

配制方法：将苏木精溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水，溶解后将甘油倾入一起混合，最后加入冰醋酸和碘酸钠。

实验程序

1.精子的发生过程

（1）精巢制片——Feulgen染色法

①取材：处死小鼠，取其精巢，用解剖针在精巢上刺几个小孔。

②固定：卡诺氏固定液固定0.5～2 h。

③脱水：85%、95%、100%乙醇各1 h。

④透明：先在100%乙醇与二甲苯混合液中0.5 h，然后在二甲苯中0.5 h，中间换1次二甲苯。

⑤浸蜡：二甲苯与石蜡等量混合液0.5 h，纯石蜡中换2次，每次0.5 h。

⑥包埋：将精巢包埋于石蜡中。第5、6步在组织包埋机中进行，包埋机温度为56℃。

⑦切片：切片厚度为7 μm。

⑧Feulgen染色：石蜡切片溶蜡：溶蜡二甲苯Ⅰ（3～5 min），溶蜡二甲苯Ⅱ（3～5 min），1/2纯乙醇+1/2二甲苯（3～5 min）；复水：无水乙醇Ⅰ（2～3 min），无水乙醇Ⅱ（2～3 min），95%乙醇（2～3 min），85%乙醇（2～3 min），70%乙醇（2～3 min），蒸馏水；水解：1 mol/L HCl，过一下，1 mol/L HCl，60℃，8～10 min（水浴或温箱中）；染色：Schiff试剂染色（60 min）；漂白：亚硫酸水Ⅰ（2 min），亚硫酸水Ⅱ（2 min），亚硫酸水Ⅲ（2 min），自来水清洗(5～10 min)，蒸馏水，过一下；对染：0.5%固绿乙醇溶液（10 s），蒸馏水，过一下；脱水：95%乙醇（2 min），无水乙醇Ⅰ（2 min），无水乙醇Ⅱ（2 min）；透明：透明二甲苯Ⅰ（2 min），透明二甲苯Ⅱ（2 min）；封片：中性树胶封片。

（2）小鼠精巢切片观察（附图1-1）

先用低倍镜观察曲精小管不同切面的全貌，然后转换高倍镜，找一个较清楚的曲精小管切面，从管壁到管腔依次认出：

精原细胞：靠基膜的一层或两层细胞，细胞核大而圆，染色深。

初级精母细胞：比精原细胞大得多，往往在分裂期间，染色质正在形成染色体。

次级精母细胞：比初级精母细胞小，胞核圆，染色淡，接近管腔。

精子细胞：体积小，最近管腔。染色最深，多呈梭形和细杆状。(www.daowen.com)

精子：成簇聚集于管腔或支持细胞上。

支持细胞：夹杂分布于生殖细胞间，锥形或不规则形，细胞核靠近基部。形状不定，染色淡，细胞轮廓不易认出。

附图1-1　小鼠曲精小管中精子的发生过程

2.成熟精子的形态观察（活体）

剪开刚处死的家兔附睾的一端，轻微将其断面在清洁过的载玻片上涂一下，然后加0.9%生理盐水一滴于涂片上，盖上盖玻片在高倍镜下观察。可看见家兔高级分化型的，有头尾结构的精子作活泼的运动。

再加上一滴苏木精染液于盖玻片一侧，用吸水纸在盖片的另一侧吸水，将染液引至材料上，约1 min后，即可在显微镜下观察，则头尾较为明显（似人类精子）。

3.卵子的发生过程

（1）卵巢的切片制作——HE染色法

①取材：处死家兔，取其卵巢。

②固定：卵巢于生理盐水中清洗后，用Bouin氏固定液固定24 h。

③脱水：取出卵巢，用刀片分割成5～8 mm小块，用70%乙醇清洗3次后于70%乙醇中保存（过夜）。取出组织进行逐级脱水，80%乙醇（2～3 h）；90%乙醇（2～3 h）；95%乙醇I（2 h）；95%乙醇Ⅱ（2 h）；无水乙醇Ⅰ（2 h）；无水乙醇Ⅱ（2 h）。

④透明：1/2二甲苯+1/2乙醇（过夜），然后在二甲苯中0.5～1 h，中间换一次二甲苯。

⑤浸蜡：二甲苯与石蜡等量混合液0.5 h，纯石蜡中换2次，每次0.5 h。

⑥包埋：将卵巢在包埋台上进行石蜡包埋。

⑦切片：切片厚度为7～8 μm。

⑧HE染色：脱蜡：二甲苯Ⅰ（15 min），二甲苯Ⅱ（15 min），1/2乙醇+1/2二甲苯（5 min）；复水：无水乙醇Ⅰ（5 min），无水乙醇Ⅱ（5 min），95%乙醇（5 min），90%乙醇（5 min），80%乙醇（5 min），70%乙醇（5 min），蒸馏水Ⅰ（5 min），蒸馏水Ⅱ（5 min）；染色：埃里希氏苏木精（15～30 min），自来水冲洗（5 min）；分化：1%盐酸乙醇（20 s），自来水冲洗（稍洗），1%氨水乙醇（4 s），蒸馏水Ⅰ（3 min），蒸馏水Ⅱ（3 min）；复染：1%伊红（3 min）；脱水：70%乙醇（30 s），80%乙醇（30 s），90%乙醇（5 min），95%乙醇（5 min），无水乙醇Ⅰ（5 min），无水乙醇Ⅱ（5 min）；透明：1/2二甲苯+1/2乙醇（5 min），二甲苯Ⅰ（10 min），二甲苯Ⅱ（10 min）；封片：将染色完成的切片取出，确保二甲苯未干燥，迅速用移液枪吸取树胶滴在组织上，盖上盖玻片，待凝固后观察结果。

（2）家兔卵巢切片观察

取切片置低倍镜下，观察滤泡在卵巢中分布情况（附图1-2）。依次高倍镜观察初级滤泡的生长过程和次级滤泡的形态（附图1-3、4）。

附图1-2　家兔卵巢切面

附图1-3　初级滤泡

附图1-4　次级滤泡

实验注意事项

1.为了让固定液能渗入到精巢中，用解剖针在精巢上刺一些小孔。

2.用固绿乙醇溶液复染时，为避免过染，这一步一定要快。

3.将染色完成的切片取出，确保树胶能很好地扩散，在二甲苯未干燥时迅速在组织上滴加树胶。

思考题与作业

1.简述哺乳动物精子与卵子的发生过程。

2.卵子与精子在发育上有何异同。

3.简述HE染色的过程。

参考文献

丁汉波,仝允栩，黄浙.发育生物学[M].北京：高等教育出版社,1987.

曲漱惠,李嘉泳,黄浙,等.动物胚胎学[M].北京：人民教育出版社,1980.

杨轩.家兔卵巢石蜡切片HE染色影响因素的研究[J].安徽农学通报,2009,15(1)：40-41.

（李巧峡，梁桂霞）