生物柴油是通过可再生的油脂资源（如动植物油脂、微生物油脂、废食用油）与短链醇（如甲醇、乙醇）等经过转酯反应，生成的长链脂肪酸酯类物质，是一种可以替代普通柴油使用的环保燃油。生物柴油是继生物燃料乙醇之后的第二大生物基液体燃料，具有润滑性能高、储运安全、抗爆性能好、燃烧充分等优良性能，还具有能量密度高、可再生、易生物降解、含硫量低等特点。大力发展生物柴油对经济可持续发展，推进能源替代，减轻环境压力，控制城市环境污染具有重要的战略意义。生物柴油的原料油可分为植物油脂、动物油脂、废弃油脂以及新兴的微生物油脂等。原料油成本占总成本的50%～85%，成为决定生物柴油最终价格的关键因素。各国在原料油的选择上区别较大，欧美国家多数以大豆油、菜籽油、芥末籽油等作为原料油，而东南亚各国基本使用棕榈油，日本则一般使用餐饮废油，我国主要采用麻风树油、黄连木油等木本油脂和地沟油等废弃油脂。与传统油脂相比，利用微生物生产油脂具有油脂含量高、生产周期短、生产成本低等优点。微生物油脂发酵是生物柴油产业和生物经济的重要研究方向。

一、生物柴油的生产原理

生物柴油是指以各种来源的甘油三酯为原料，在某种催化剂的作用下与甲醇进行反应，甲醇替换甘油三酯中的醇，得到脂肪酸甲酯，同时产生副产物甘油（图12-7）。该过程也称为醇解。生物柴油生产过程所涉及的化学反应主要包括油脂的水解反应、酯化反应和酯交换反应。

图12-7 油脂酯交换反应过程

目前，用于制备生物柴油的方法主要有直接使用和混合法、微乳液法、热解法和酯交换法。采用酯交换法生产生物柴油因其反应条件温和、工艺操作简单、成本较低，而且制得的生物柴油性质稳定，已经成为研究的主流。酯交换反应由于催化剂选择的不同，可分为均相酸碱催化法、非均相酸碱催化法、超临界法和脂肪酶催化法。各生产方法比较见表12-6。

表12-6 生物柴油生产方法比较

续表

生物柴油化学生产方法具有工艺复杂、能耗高、环境污染严重等缺点；而用脂肪酶催化合成法可以有效避免上述问题，具有广阔的应用前景。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异等特点，微生物来源的脂肪酶作用pH、作用温度范围以及底物专一性比动植物来源的脂肪酶优越，且适合于工业化生产，因此微生物脂肪酶是生物柴油生产中的研究热点之一。

二、酶法生产生物柴油

生物催化剂主要是脂肪酶（lipase，E.C.3.1.1.3），包括细胞内脂肪酶和细胞外脂肪酶。脂肪酶来源广泛，具有选择性、底物与功能专一性，在非水相中能发生催化水解、酯合成、转酯化等多种反应，且具有反应条件温和、无需辅助因子等优点。这些优点使脂肪酶成为生物柴油生产中一种适宜的催化剂。研究表明，脂肪酶是一种很好的催化醇与脂肪酸甘油的酯交换反应催化剂。微生物脂肪酶的种类多、来源广，具有较高的催化活性和稳定性，是重要的工业酶。高产脂肪酶微生物菌株多来源于细菌、酵母菌和霉菌。已报道的产脂肪酶微生物大约65个属，其中细菌28个属、放线菌4个属、酵母菌10个属、其他真菌23个属（表12-7）。

表12-7 主要产脂肪酶微生物

脂肪酶通常既可以水解长链底物也可以水解短链底物，除了催化酯类水解还可以催化酯化、转酯、醇解、氨解等多种反应。脂肪酶活力中心的构象结构决定了其往往只能结合某一类特征结构的底物，且不同来源的脂肪酶活力中心构象均存在一定差异，因此这些反应通常具有很强的底物特异性，具体表现为：①底物特异性，酶的底物特异性与其结构和酶的活性中心有关。不同来源的脂肪酶水解由单一脂肪酸组成的甘油三酯的特异性有很大差异。例如，圆弧青霉产生的脂肪酶对短链（C₈以下）脂肪酸具有特异性，黑曲霉和根霉产生的脂肪酶对中等链长（C₈～C₁₈）脂肪酸具有特异性，而白地霉产生的脂肪酶对三油酸（不饱和脂肪酸）呈强特异性，Fusarium oxysporum脂肪酶优先作用于饱和脂肪酸。②位置特异性，是指脂肪酶对甘油三酯的1、2、3位酯键的识别和水解的反应特异性。除少数脂肪酶，如来源于S.aureus和S.hyicus的脂肪酶、Corynebacterium acne的脂肪酶等没有位置特异性之外，大多数脂肪酶均为1、3位特异性，虽然许多脂肪酶几乎不能水解2位酯键，但是由于存在酰基转移现象，即随着1、3位酯键的水解，2位的脂肪酸会转移到1、3位，最终甘油三酯得以完全水解。③对映体选择性，是指脂肪酶只对两种对映体（R构象或S构象）中的一种发生反应，最终可以将R构象或S构象从外消旋混合物中分离出来，这个过程也称为对映体拆分。目前已发现多种脂肪酶，如来源于B.cepacia、A.niger、C.antarctica等的脂肪酶均存在这种对映体选择性，只是其能拆分的底物各有不同。因此，脂肪酶被广泛应用于拆分各种不同的旋光异构体。

三、产油微生物

微生物油脂（microbialoils）又称为单细胞油脂（single cell oil，SCO），是由酵母、霉菌、细菌和藻类等微生物在一定条件下利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂为碳源，在菌体内产生大量的油脂。如果油脂含量超过生物总量的20%，即称为产油微生物（oleaginous microorganisms）。产油微生物资源丰富，能在多种培养条件下生长，进行工业规模生产和开发有着巨大的潜力。目前，微生物油脂已成为获取高附加值脂肪酸，如γ-亚麻酸（GLA）、花生四烯酸（ARA）、二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）等的重要原料。而且，由于某些微生物油脂在脂肪酸组成上同植物油，如菜籽油、棕榈油、大豆油等相似，富含饱和和低度不饱和长链脂肪酸，是生产生物柴油的潜在原料。产油细菌在合适条件下能积累油脂，但多数细菌积累的并不是甘油三酯，而是其他的一些类脂，如磷脂和糖脂，少数细菌如分支杆菌属（Mycobacterium）、诺卡菌属（Nocardia）、浑浊红球菌（Rhodococcus opacus）和弧菌属（Vibrio spp.）的一些菌株可以积累甘油三酯，但这些甘油三酯附着于细胞外膜上，提取十分困难。因此，研究应用较多的产油微生物多集中于产油真菌和产油微藻。

1.产油真菌

产油酵母种类繁多。酵母菌在油脂发酵过程中能累积较大的生物量，并且原料来源广泛，受到科研工作者的极大关注。目前已报道的累积油脂能力较强的酵母菌有：胶黏红酵母（Rhodotorula glutinis）、浅白色隐球酵母（Cryptococcus albidus）、圆红冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）、出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）、解脂亚罗威亚酵母（Yarrowia lipolytica）、斯达油脂酵母（Lipomyces starkeyi）和发酵丝孢酵母（Trichosporonfermentans）等。多种霉菌也能够在特殊的培养条件下合成油脂。常见的产油霉菌有深黄被孢霉（Mortierella isabellina）、土曲霉（Aspergillus terreus）、高山被孢霉（Moriterella alpina）、小克银汉霉属（Cunnighamella）、毛霉属（Mucor）、水霉属（Saprolegnia）和高粱褶孢黑粉菌（Tolypospofium ehrenbergii）等（表12-8）。

表12-8 常见产油真菌油脂含量

在酵母菌、霉菌等真核微生物中，某些产油种属能积累占其生物总量70%以上的油脂，其中以甘油三酯（triacylglycerol，TAG）为主，约占80%以上，磷脂约占10%以上。TAG的主要功能是作为碳源和能源的储备化合物，另外还具有维持膜结构完整和正常功能的作用。(www.daowen.com)

2.产油真菌合成油脂的过程及代谢调控

真菌合成油脂的过程与动植物产生油脂的过程相似。首先，由乙酰辅酶A羧化酶催化乙酰辅酶A的羧化反应，生成丙二酸单酰辅酶A。乙酰-CoA和丙二酸单酰-CoA在脂肪酸合酶复合体的催化下生成丁酰-ACP（酰基载体蛋白）。丁酰-ACP会进入第二轮的碳链延伸，延伸两个碳原子单元。这样，经过多次酰基链延长和随后的去饱和作用等步骤形成了完整的脂肪酸合成途径。在此过程中，有两个主要的催化酶，即乙酰-CoA羧化酶和去饱和酶。乙酰-CoA羧化酶催化脂肪酸合成的第一步，是第一个限速酶。此酶是由多个亚基组成的复合酶，结构中有多个活性位点，因此该酶能为乙酰-CoA、ATP和生物素所激活。去饱和酶是微生物通过氧化去饱和途径生成不饱和脂肪酸的关键酶，这一过程称之为脂肪酸氧化循环。黏红酵母油脂的合成过程可分为四个环节：两个前体乙酰-CoA和3-磷酸甘油的形成；甲羟戊酸的合成，乙酰-CoA形成脂酰-CoA和鞘脂；以甲羟戊酸为前体合成甾醇、类胡萝卜素和碳水化合物；以乙酰-CoA和3-磷酸甘油为前体合成磷脂酸、甘油二脂、甘油三脂和磷脂。由此可见，在酵母细胞内油脂合成的多少中，乙酰-CoA起了主导作用；而乙酰-CoA的形成又受到氮源多少、AMP和异柠檬酸脱氢酶活力等诸多因素的影响。微生物高产油脂的一个关键因素是培养基中碳源充足，其他营养成分特别是氮源缺乏。在这种情况下，微生物不再进行细胞繁殖，而是将过量的碳水化合物转化为脂类。

产脂微生物中的油脂积累是一系列复杂的对油脂合成代谢调控的结果。目前，对产油酵母和产油霉菌转化葡萄糖积累TAG代谢途径已有较深入的认识。以产脂酵母为例（图12-8），当氮源耗尽时，产脂微生物的磷酸腺苷（AMP）脱氨酶活力增加，将AMP大量转化为肌苷磷酸（IMP）和氨，以作为氮源的应激补偿。造成胞内AMP浓度显著降低，在产脂酵母线粒体中依赖AMP的异柠檬酸脱氢酶（ICDH）活性随之下降甚至完全失活，TCA循环受到抑制，代谢发生改变，积累的柠檬酸通过苹果酸/柠檬酸转移酶转运出线粒体到细胞质中，并在ATP∶柠檬酸裂解酶（ACL）的作用下生成乙酰辅酶A和草酰乙酸。前者在脂肪酰合成酶（FAS）的作用下生成脂肪酰-CoA，进而合成TAG；后者在苹果酸脱氢酶（MDH）作用下生产苹果酸，再在苹果酸酶（ME）的作用下生产丙酮酸（pyruvate），同时释放出NADPH。NADPH作为重要的辅助因子，对脂肪酸链延伸作用的脂肪酸合成酶（FAS）具有选择特异性，即FAS只能利用ME催化反应释放的NADPH。这样伴随着油脂大量积累，在细胞溶胶中合成脂肪所需的乙酰-CoA及催化脂肪酸链延伸的FAS辅因子NADPH不断供给。因此现在普遍认为在产脂微生物中一系列复杂的油脂积累生化过程中，柠檬酸裂解酶（ACL）和苹果酸酶（MEA）是其代谢调控的两个关键酶。细胞溶胶中ACL和MEA的活性与油脂合成能力具有很强的相关性，如果ME受到抑制，则油脂积累就下降。

图12-8 产油酵母油脂积累代谢调控途径

在脂肪酸的合成过程中，乙酰辅酶A的生成和NADPH的供应是调控脂类生成的两个重要方面，任何增加这两种物质生成的措施（超量表达苹果酸酶基因）都有可能对产油真菌油脂含量的增加产生积极的作用。

3.产油微藻

微藻能够有效利用太阳能，通过光合作用固定二氧化碳，将无机物转化为氢、高不饱和烷烃、油脂等能源物质。藻类种类繁多，广泛分布于海洋、湖泊、陆地等。许多藻类（主要指单细胞微藻）能够在细胞中积累大量油脂。与陆地植物相比，藻类生长周期短，生长速度快，可以连续采收，达到较高的生物产量。因而，微藻被认为是最具潜力的生物柴油原料。相较于传统的生物柴油原料，微藻生物柴油具有明显的优势：①微藻培养不需要占用大量耕地，且微藻可在海水、废水等多种水体环境中生长，无需提供专门的水源，这大大降低了微藻培养的成本；②微藻易于培养，对环境的适应性强，可在多种极端的环境中培养，降低了管理成本，且微藻生长速度快，这为生物柴油的供应提供了可靠保障；③微藻光合效率高，可有效地固定CO₂，且微藻生长的过程中可大量吸收水中的N、P等营养元素，可用于富营养化水体的净化；④微藻的含油量比传统的产油作物的含油量高，更适合作为生物柴油生产的原料。

富含脂质的微藻主要存在于四个主要类别中：硅藻类、绿藻类、蓝绿藻类和金藻类。不同种类的产油微藻，脂质含量不同（表12-9）。正常条件下许多产油微藻的脂质含量可以达到细胞干重的20%～50%，葡萄藻（Botryococcus braunii）细胞内的脂质含量甚至可占生物干重的75%，远超过最好的产油作物。

表12-9 部分微藻含油率

4.自养微藻合成生物油脂的机理

自养微藻可通过光合作用合成生物油脂，其油脂的合成和积累过程可分为发酵培养前期和后期两个阶段。发酵培养前期为细胞增殖期，微藻大量消耗培养基中的碳源和氮源等营养物质，以保证微藻细胞的代谢和增殖，此阶段合成的油脂主要以磷脂的形式存在，用来构成细胞骨架。发酵培养后期，当培养液中碳源充足而某些营养成分（特别是氮源）缺乏时，微藻细胞分裂速度降低，微藻不再进行细胞增殖，而过量的碳元素继续被微藻吸收，在细胞质中经糖酵解途径进入三羧酸循环，同时激活甘油三酯的积累。甘油三酯是生产生物柴油的主要原料，它在微藻中的合成途径包括乙酰辅酶A的形成、脂肪酸碳链的延长和去饱和、甘油三酯的合成三步。

（1）乙酰辅酶A的形成微藻利用光反应生成的NADPH和ATP，在羧化酶作用下固定CO₂，生成磷酸甘油酸，而后被还原成磷酸甘油醛。磷酸甘油醛从叶绿体转移到细胞质后，用于合成糖类或通过糖酵解途径转化为丙酮酸。丙酮酸再进行氧化脱羧转化为乙酰辅酶A。乙酰辅酶A作为脂肪酸生物合成的起始物，参与脂肪酸碳链的合成。

（2）脂肪酸碳链的延长和去饱和脂肪酸合成起始于乙酰辅酶A转化为丙二酸单酰辅酶A，而后乙酰辅酶A和丙二酸单酰辅酶A通过启动、装载、缩合、还原、脱水和再还原等反应合成软脂酸。长链脂肪酸或不饱和脂肪酸需以软脂酸为前体，通过碳链的延长和去饱和实现。其中碳链的延长依赖于乙酰辅酶A羧化酶和脂肪酸合酶的催化，且需丙二酰辅酶A的参与。而脂肪酸碳链的去饱和与延长由饱和18碳脂肪酸（C_18∶0）开始，在去饱和酶与脂肪酸延长酶的交替作用下，产生一系列在植物油脂中不常见的长链（C₂₀～C₂₂）脂肪酸。其过程如图12-9所示。

图12-9 脂肪酸碳链的延长和去饱和过程

（3）甘油三酯的合成像其他高等植物一样，微藻中绝大多数的脂肪酸（包括饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸）通过合成甘油三酯以储存物质和能量。而甘油三酯是由脂酰辅酶A和L-α-磷酸甘油2个前体合成的。其中脂酰辅酶A来自上一步中脂肪酸的活化，L-α-磷酸甘油来自于糖酵解的中间体二羟基丙酮磷酸，合成过程如图12-10所示。

图12-10 微藻中甘油三酯的生物合成途径