微生物发酵制取乙醇是主要的生产燃料乙醇的方法。由于生产原料的不同，发酵法生产乙醇又分为糖类原料直接发酵生产乙醇；用淀粉原料经过淀粉水解后再发酵生产乙醇；结构复杂的纤维质原料，先经过预处理，再经过水解的方法将其转化为糖，最后发酵生产乙醇。发酵法生产乙醇的基本过程就是将原料转化为六碳糖和五碳糖，经过酵母菌等乙醇发酵微生物在无氧条件下利用其特定酶系统所催化的一系列有机质分解代谢的生化反应过程产生乙醇，最终提纯乙醇。由淀粉和纤维质原料生产乙醇的生化反应过程可以概括为3个阶段：①淀粉、纤维素和半纤维素，水解为葡萄糖、木糖等单糖分子；②单糖分子经糖酵解形成2分子丙酮酸；③无氧条件下丙酮酸被还原为2分子乙醇，并释放出CO₂。

一、六碳糖发酵微生物及其代谢机理

工业上应用较为成熟的六碳糖乙醇发酵菌种主要为酵母菌和细菌。其中，酿酒酵母和运动发酵单胞菌为典型代表菌株。

1.六碳糖发酵生产乙醇的酵母菌

在厌氧条件下，酿酒酵母通过糖酵解途径（EMP途径）将葡萄糖分解为两分子丙酮酸，然后丙酮酸脱羧生成乙醛，乙醛作为氢受体使NAD ⁺再生，发酵终产物为乙醇。理论上，1g葡萄糖经完全发酵产生0.51g乙醇。常用的酵母品种有酿酒酵母、葡萄汁酵母（S.uvarum）、裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）及克鲁维酵母（Kluyveromyces）等。酵母菌均为兼性厌氧菌，有氧气时进行菌体的生长，厌氧条件下转入乙醇发酵阶段。酿酒酵母的发酵性能直接影响着乙醇生产的成败，因而选育性能优良的菌株格外重要。近年来，通过基因工程和代谢工程等现代生物技术手段，可以有目的地构建发酵性能优良的菌株，调控微生物代谢过程。基因工程菌株构建的方向主要有以下几个：一是扩大可供利用的底物范围，如构建出可以同化木糖、L-阿拉伯糖等五碳糖并发酵生成乙醇的菌株，或者改变利用底物的方式，如构建可以直接利用淀粉原料进行发酵的菌株；二是提高菌株的耐酒精性能以及耐高温性能；三是改变菌株的代谢途径使之特异性地转向乙醇生产，提高乙醇对糖的收率，以降低燃料乙醇生产的原料消耗。

2.六碳糖发酵细菌

许多细菌能够代谢葡萄糖产生乙醇，同时还会产生有机酸、酮等其他副产物及H₂、CO₂等气体。以乙醇为主要发酵产物的代表细菌见表12-5。其中，属于发酵单胞菌属的兼性厌氧的革兰阴性杆状细菌——运动发酵单胞菌，乙醇产率较高，最具有实际应用价值，将来有可能取代酵母菌成为乙醇发酵工业的主要菌种。

表12-5 以乙醇为主要发酵产物的细菌及其乙醇产率

与酿酒酵母的EMP途径不同，运动发酵单胞菌是通过ED途径将葡萄糖发酵生成乙醇，1mol葡萄糖代谢仅产生1mol ATP（图12-4）。乙醇的发酵过程是葡萄糖分子在碳六位上磷酸化，并在NADP的参与下，脱氧形成6-磷酸葡萄糖酸，然后在6-磷酸葡萄糖酸脱水酶的作用下，脱水形成2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸（KDPG），接着在脱氧葡萄糖酸醛缩酶的作用下裂解为3-磷酸甘油醛和丙酮酸，3-磷酸甘油醛转入EMP途径的后部分，转化为丙酮酸。丙酮酸再脱羧生成乙醛，乙醛被还原生成乙醇。该途径也称为KDPG途径。

图12-4 运动发酵单胞菌乙醇发酵途径

ED途径的特点是葡萄糖只经过4步反应即可快速获得由EMP途径需经10步反应才能够形成的丙酮酸，加之运动发酵单胞菌菌体较小，比表面积大的特点，理论上乙醇发酵的速率会更快。这条途径的关键是KDPG的3，3裂解，分解为3-磷酸甘油醛和丙酮酸。ED途径的产能水平较低，1mol葡萄糖分解为2mol丙酮酸时，只净得1mol ATP和2mol NADH。因此理论上运动发酵单胞菌比酿酒酵母产生更少的生物量，使更多的碳流向乙醇发酵。有报道运动发酵单胞菌的乙醇表观产率能达到利用葡萄糖发酵产生乙醇理论产率的97%，然而酵母只能达到90%～93%。利用运动发酵单胞菌生产乙醇与广泛采用的酵母菌相比有较强的优势：发酵温度比酵母菌高，对糖的发酵速度及利用率均高于酵母菌，可以缩短生产周期和提高原料的利用率；发酵过程中不需要通气，设备工艺比较简单，有利于采用连续发酵、无载体固定化等先进的工艺控制来降低乙醇的生产成本；与酵母菌相比，该菌代谢途径相对简单，没有多种可供选择的代谢途径。尽管有很多优势，但该菌株底物谱狭窄，只能代谢葡萄糖、果糖和蔗糖，而且在蔗糖中生长时会伴随产生胞外果聚糖和山梨醇，严重降低乙醇的表观产率，不适于利用糖质原料如糖蜜等生产乙醇。为了解决这些问题，已对运动发酵单胞菌进行了大量的遗传改造尝试。例如，将一些微生物的相关水解酶基因转移到运动发酵单胞菌中；通过传统的变异和筛选方式，获得具有优良发酵性能且无副产物产生的突变株。另外，产生乙醇的pet操纵子由运动发酵单胞菌的pdc（丙酮酸羧化酶基因）和adhB（乙醇脱氢酶Ⅱ基因）融合构建而成，转移到碳源利用范围较广的微生物中，可以构建产生新的产乙醇工程菌株。

二、五碳糖发酵微生物及其代谢机理

木糖是木质纤维素水解物中含量仅次于葡萄糖的一种单糖，天然半纤维素水解产物的85%～90%是木糖。然而，传统上用于乙醇发酵生产的微生物如酿酒酵母和运动发酵单胞菌虽然能够很好地利用六碳糖（葡萄糖），但均不能代谢五碳糖（木糖）。以植物纤维素原料中的木糖发酵生产乙醇，能使木质纤维素原料的乙醇发酵产量在原有的基础上增加25%。因此，实现木糖发酵生产乙醇是决定植物纤维资源生产乙醇经济可行的关键因素。(www.daowen.com)

1.自然界中能利用五碳糖的微生物

（1）酵母菌酵母菌利用木糖转化为乙醇的能力较强，主要有管囊酵母（Pachysolentannophilus）、树干毕赤酵母（Pichia stipitis）和休哈塔假丝酵母（Candida shehatae）3种类型，其中研究最多且最具有工业应用前景的是树干毕赤酵母和休哈塔假丝酵母。在发酵木糖的过程中，限氧发酵是这类菌利用木糖发酵乙醇的特点，木糖醇是主要的副产物。在厌氧环境中发酵，会导致积累大量的木糖醇，菌株发酵停止；氧气含量过大的发酵过程，会导致产物乙醇被同化为高分子物质或氧化为酸，聚乙烯乙二醇可以对这种同化过程产生抑制作用。为使累积的NADH氧化为NAD ⁺，可以向培养物中加入3-羟基丁酮或丙酮乙醛等受氢体，从而恢复乙醇的产生。少量葡萄糖的存在，有益于木糖的发酵。这是由于细胞的呼吸活性可以被一定量的葡萄糖所抑制，即Crabtree效应。木材水解液中的芳香类、有机酸和金属离子等物质，均是此类木糖发酵菌的抑制物，而且单一抑制物彼此之间还存在着协同作用，导致天然纤维材料水解物的酵母菌发酵产量低并且速率慢。

（2）细菌细菌发酵的底物广泛（包括单糖、高聚糖等），发酵时间短。能发酵木糖产生乙醇的细菌主要有嗜热氧化硫芽孢梭菌（Clostridium thermohydrosulfuricum）、多黏芽孢杆菌（Bacillus polymyxa）、大肠杆菌（Escherichia coli）、嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）等。细菌发酵木糖具有发酵时间短、传代快的优点。与此同时，由于乙醇的产生伴有诸如有机酸和其他醇类的一些副产物，导致其终产物的种类受培养基组分、发酵条件等的影响较大，酒精得率比较低；另一方面，细菌在高pH条件下的发酵容易出现杂菌污染的问题。以上两种问题的存在，致使此类菌株尚未进入实际的应用。

（3）丝状真菌 丝状真菌发酵木糖的研究主要集中在尖廉孢菌（Fusarium oxysporum）和粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）。目前报道能发酵木糖产乙醇的真菌主要有F.oxysporum VTT-D-80134、Neurospora crassa NCIM870、Paecilomyces sp.NFI.ATCC20766和F.sambucium VTT-D-77056等。虽然这类菌传代慢、发酵时间较长，而且在发酵过程中容易受木质素及芳香类物质的抑制；但是这些问题可以通过筛选抑制物抗性菌株、加大接种量等方法来解决。另外，粗糙脉孢菌以及尖镰孢菌不但具有利用戊糖和己糖发酵乙醇的能力，而且自身具有半纤维素酶及纤维素酶，可以大大简化利用天然纤维原料生产乙醇的工艺，降低生产成本。

此外，通过基因工程技术也可获得可代谢木糖的重组菌株。研究思路主要有两条，一是向高效代谢六碳糖的菌种中引入五碳糖代谢途径；二是向能利用混合糖但产乙醇能力低的菌种中引入高产乙醇的关键酶基因。构建基因重组菌常用的宿主菌种有酿酒酵母、运动发酵单胞菌和大肠杆菌。

2.五碳糖乙醇发酵机制

五碳糖发酵机制研究主要集中于微生物代谢木糖的机制研究上。木糖的异构化是微生物木糖代谢的最初生化反应。到目前为止，微生物转化木糖成乙醇的途径主要有细菌和真菌的木糖代谢途径，主要表现在木糖转化为木酮糖途径的差异上。

细菌的木糖代谢途径，首先在木糖异构酶（xylose isomerase，XI）的催化作用下转化为木酮糖，木酮糖在木酮糖激酶（xylulokinase，XK）的作用下转变成为磷酸木酮糖，继而进入磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway，PPP），再通过糖酵解途径或ED途径生成丙酮酸，经丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶作用转化为乙醇。其代谢过程如见图12-5所示。

酵母菌及丝状真菌的木糖代谢途径，需要经过两步氧化还原反应将木糖转化为木酮糖。首先在依赖NADPH的木糖还原酶（xylose reducase，XR）作用下将木糖还原为木糖醇；然后木糖醇被依赖NAD ⁺的木糖醇脱氢酶（xylitol dehydrogenase，XDH）氧化为木酮糖。木酮糖经木酮糖激酶（xylulokinase，XK）作用磷酸化后进入PPP途径，PPP途径的中间产物6-磷酸葡萄糖及3-磷酸甘油醛通过酵解途径形成丙酮酸，丙酮酸或是经丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶脱羧还原为乙醇，或是在好氧的条件下，通过TCA循环及呼吸链彻底氧化成CO₂。酿酒酵母因缺乏木糖代谢途径关键酶而不能利用木糖，但可以利用木糖的异构体木酮糖。在酿酒酵母菌中，木酮糖也是先磷酸化形成5-磷酸木酮糖，进入PPP途径，经酵解形成乙醇。其代谢过程如图12-6所示。

图12-5 细菌木糖代谢途径

图12-6 酵母菌木糖代谢途径

以酵母菌为例，木糖发酵在兼性厌氧的条件下进行，总反应式为：6C₅H₁₀O₅→9C₂H₅ OH+12CO₂。木糖发酵乙醇的最高产率为0.46g/g，低于葡萄糖乙醇发酵的理论得率0.51g/g。