当前，全球环境污染物种类在不断地增加，特别是低浓度、危害严重的痕量污染物对环境造成的污染越来越重，对环境监测提出了更高的要求。采用操作简单、费用较低的微生物检测技术，结合高精度分析仪器和方法，是未来环境监测的发展方向。生物监测是利用各种生物对环境污染或环境变化所产生的反应，即研究生物个体、种群、群落在各种污染水平中发出的各种信息，来判断环境污染的程度，以便从生物学的角度为环境质量的监测和评价、污染控制、环境管理等提供依据，包括利用新的指示生物监测评价环境，利用核酸探针和PCR技术监测评价环境，利用生物传感器及其他方法监测评价环境。其中，环境微生物监测技术是环境生物监测技术的重要组成和代表方法之一。
一、生物传感器
1.生物传感器的基础知识
生物传感器（biosensor）是以酶、微生物、DNA、抗原或抗体等具有生物活性的生物材料作为分子识别元件，将外界对其理化性质的影响转化为电磁信号的装置，可用于快速、精确、简便地监测特定环境污染。生物传感器一般由生物识别元件、转化元件、信号调节元件、数据处理器和信号发生器组成。生物识别元件可以是生物体、组织、细胞、细胞器、细胞膜、酶、酶组分、感受器、抗体、核酸、有机物分子等。原始信号产生的来源包括：H +浓度的变化，一些气体如氨和氧气的吸收和释放，光的释放、吸收或反射，生物质的改变等。信号传导器的主要形式有电势测量式、电流测量式、电导率测量式、阻抗测量式、光强测量式、热量测定式、声强测量式、机械式等，其主要功能是将生物元件与被测物质相互作用所产生的物理化学效应转变为可以输出的电信号。
原始信号的产生机理与识别元件和待测物质的作用有关，主要有以下4种：①将化学信号转变为电信号，如酶传感器是把底物量的变化转化为电信号；②将热变化转化为电信号，利用固定化生物材料与相应待测物作用时产生的热变化，通过热敏电阻转化为阻值的变化，再经放大器输入记录仪；③将光效应转化为电信号，有些酶如过氧化氢酶能催化过氧化氢-鲁米诺体系发光，通过光敏二极管与光电流测定装置连接；④直接产生电信号，主要利用酶或微生物细胞的氧化，直接通过电子传递作用在电极表面发生。
生物传感器的分类方式有多种。根据信号转换方式可分为压电晶体生物传感器、电化学生物传感器、声学及光学生物传感器等；根据生物敏感物质相互作用的类型可分为亲和型生物传感器和代谢型生物传感器；根据识别元件上的明暗物质可分为酶生物传感器、微生物生物传感器、免疫生物传感器、DNA生物传感器、组织生物传感器、细胞生物传感器等。
与传统的分析手段和方法相比，生物传感器具有如下优点：①一般不需要进行样品预处理，也不需要添加其他试剂；②可以连续在线监测；③响应快，样品用量少，可以反复多次使用；④成本较低，便于推广使用。
2.生物传感器在环境监测中的应用
在各种生物传感器中，微生物传感器最大的优点是成本低、操作简便、设备简单，因此具有十分巨大的市场前景。然而，微生物传感器也有其自身的缺点。由于微生物细胞中含有多种酶，因而会出现选择性不够好。通过添加专门抑制剂可解决微生物电极的选择性问题。此外，微生物固定化方法也需要进一步地完善：要尽可能地保证细胞的活性；细胞与基础膜结合要牢固，以避免细胞的流失；要进一步改进微生物膜的长期保存问题，以实现大规模的商品化生产与应用。
（1）在农药监测中的应用目前，在农药监测中研究较多的是乙酰胆碱酯酶类传感器，该传感器可检测10nmol/L对氧磷，并可稳定2个月，在4℃磷酸盐缓冲液中可储存1年。将胆碱氧化酶和丁酰硫代胆碱酯酶共同固定在膜上对马拉硫磷、对硫磷进行监测，检测限分别可达2μg/g和6μg/g，已成功地用于地表水和土壤样品中几种农药的回收研究。
（2）在水环境监测中的应用
①生化需氧量的测定：生化需氧量（biochemical oxygen demand，BOD）是表示水中有机化合物等需氧物质含量的一个综合指标，也是污水处理工程的重要设计参数。常规的BOD测定是用稀释与接种法来进行，需要5d的培养期，操作复杂、重复性差、耗时耗力、干扰性大，不宜现场检测。采用BOD生物传感器可在10～15min检测出BOD值，可对水质状况实行在线监测，具有广阔的应用前景。
BOD传感器以微生物的单一菌种或混合菌群固定在溶解氧探头上。当加入样品时，样品溶液中渗透过多孔膜的有机物被固定化的微生物吸收，消耗氧，使氧电极电流随时间急剧减少。通过测定电流，与标准曲线对比来测定OD值。BOD传感器常用的工作菌株有丝孢酵母（Trichosporon cufaneum）、酿酒酵母、异常汉逊酵母（Hansenula anomala）、假单胞菌和芽孢杆菌等。
目前，日本、美国、英国、德国等已有商品化的生物传感器快速BOD测定仪。我国也开发了多种微生物传感器，应用于河水、工厂、生活废污水等的BOD测定，测定几乎不受氯离子的影响，如天津市赛普环保科技发展有限公司生产的BOD微生物传感器BOD-220A、BOD-220B型等。
②氨氮、亚硝酸盐的测定：Massone等利用硝化细菌作基质与氧电极组成生物传感器，检测医院及食品工业的废水处理厂污水的氨氮。硝化细菌以氨作为唯一能源消耗氧，通过检测附着在氧电极上的固定化微生物的呼吸量可测定氨氮浓度。Larsen等将一种假单胞菌固定在小毛细管中，置于N2O小电化学传感器前端。固定化菌将
还原为N2O，随即N2O在小传感器电负性的银面还原。该传感器对0～400μmol/L的
浓度呈线性相关。采用从废水处理装置中分离出来的硝化细菌和氧电极组合构成氨氮和硝酸盐微生物传感器，测量河水的NOx效果较好，可以在黑暗和有光的条件下测量硝酸盐和亚硝酸盐（
），在盐环境下测量可不受其他种类氮的氧化物影响。
③重金属的测定：在污染区分离出一种能够发荧光的细菌，含有荧光基因，在污染源的刺激下能够产生荧光蛋白，从而发出荧光。采用遗传工程的方法将这种基因导入大肠杆菌中，制成微生物传感器，可用来检测砷等有毒化合物。Roberto等从水母中提取了一种绿色荧光蛋白，通过基因转录研制出一种细菌荧光素酶生物传感器，利用该传感器可检测亚微克量的亚砷酸盐和砷酸盐，对砷污染地区能进行在线、长期的环境监测，效果显著，且费用极低。测量污水中锌浓度的生物传感器使用嗜碱性细菌，对污水中锌的浓度和生物有效性进行测量，效果很好。
（3）其他方面的应用采用硫铁矿附近酸性土壤中分离筛选到的专性自养氧化硫硫杆菌（Thiobacillus thiooxidans）制成的微生物传感器，可用于硫化物的测定。在pH为2.5、温度为31℃时，1周测量200余次活性保持不变，两周后活性降低20%。传感器设备简单，成本低，操作方便。
生物传感器在大气和废气监测中也有广泛的应用。Knopf等研究了一种新型生物传感器，可对化工厂排放到空气中的有毒污染物进行遥感监测。该传感器采用能发光的弧菌属细菌（Vibrio）作为生物基质，当空气中存在有毒污染物时，发光细菌的发光能力受到影响而减弱，其减弱程度与有毒物质的毒性大小和浓度成一定的比例。发光细菌固定在聚乙烯醇凝胶体中，并与信号转换器组合。该转换器可以将光信号转换为无线电频率，被遥感接收器接收，从而可以测定待测物的毒性和浓度。Gil等采用埃希菌属（Escherichia）作为基质，用琼脂固定并与传导器组成生物传感器，对工厂附近的污染大气进行连续监测，能检测出空气中苯、甲苯等有毒物质的浓度变化。
二、分子水平的微生物监测技术
随着分子生物学技术的迅速发展，一些基于分子生物学的微生物技术在环境污染监测中得到了广泛的应用，呈现出美好的应用前景。
1.生物免疫检验
生物免疫检验是利用特定的抗原或抗体反应，检验分析环境物质的生物毒性。该方法具有灵敏、特异、快捷、实用和经济等优点，因而被广泛应用于环境污染物的监控。其中的酶联免疫吸附法（enzyme linked immuno sorbent assay，ELISA）广泛用于环境农药残留、微生物毒素、抗生素、激素和水体有害微生物的检测。
根据我国沿海近年来赤潮频发的问题，向军俭等用4种赤潮藻免疫Balb/C小鼠，制备针对4种不同赤潮藻的抗血清，建立了检测赤潮易弯藻（Heterosigma akashiwo）、海洋褐胞藻（Chattonelia marinn）、卵圆褐胞藻（Chattonelia ovata）和具齿原甲藻（Prorocentnmzdentatum）4种赤潮的ELISA检测方法。结果表明，4种赤潮藻的抗血清对各自藻体均有良好的亲和力和特异性。交叉反应结果显示，抗血清与同种藻之间有较强的反应，而异种赤潮藻之间交叉反应较弱，表明单种藻免疫获得的小鼠多克隆抗体可特异性地响应赤潮藻作用，可用于赤潮藻的免疫学检测分析。
大肠杆菌是环境中最常见的病害微生物。大肠菌群测定为环境微生物学中重要的检测项目之一。滤膜法和多管发酵法是检测水体中大肠菌群的常规方法，但二者均存在操作复杂、检测周期长（近80h）、检测费用较高等固有缺陷。席海燕等用夹心法和直接法（固定抗原，加入酶标一级抗体直接测定）两种ELISA方法检测了城市污水处理厂二沉池出水大肠杆菌情况，分析包被抗体和酶标抗体浓度、菌液预处理等因素对检测灵敏度的影响，确定了ELISA的最佳工作条件。结果表明，检测大肠杆菌的线性区间为（10～6）×104CFU/mL，最低检测限达到10CFU/mL。
2.基于PCR技术的微生物检测技术
（1）检测环境中的微生物种类PCR技术可直接用于土壤、废物和污水等环境标本的生物检测，包括一些不能进行人工培养的微生物检测。应用PCR技术检测环境样品中的微生物，其基本步骤为：①从环境样品中提取核酸（DNA或RNA）；②以提取的DNA或RNA为模板进行PCR扩增；③分析PCR反应产物。如Zehr等利用该技术直接从海水DNA样品中特异性地扩增到一种目前常规方法无法培养的Trichode smiumthie菌株的固氮基因（nif）片段。采用常规方法很难检出军团菌（Legionella spp.），而采用套式PCR方法则可以极准确地进行检测，检测时间仅为4h。
（2）跟踪检测环境中的基因工程菌株 基因工程菌株广泛地应用于制药、发酵、生物农药、生物肥料、污染生物修复领域。工程菌株的生存环境早已不再局限于实验器皿或发酵罐等人工封闭环境，而是越来越多地进入自然环境。在实验室条件下，细菌之间可以通过接合、转化、转导3种方式交换遗传信息。在自然环境中，工程菌株同样可以通过这3种方式与土著微生物之间交换遗传信息。因此，在广泛使用之前，基因工程菌株的生态安全问题是人类亟待解决的一个重要课题。(www.daowen.com)
Chaudry等将一工程菌株接种于已过滤除菌的湖水及污水中，定期取样并对提取的样品DNA进行PCR扩增，特异性地扩增其0.3kb DNA片段（为该工程菌株的标记基因）。结果表明接种10～14d后仍能用PCR的方法检测出该工程菌株。
（3）环境中致病菌和指示菌的测定利用PCR技术检测食品中的单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes），只需几个小时就可以完成。与传统经典培养法相比，用这种方法检测100个样品的阳性检出率相同或略高。沙门菌（Salmonella）、志贺菌（Shigella）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）、肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhagic Escherichia coli）O157和副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）是饮用水中不得检出的5种食源性致病菌。范宏英等根据它们的毒素基因、高度保守基因及特异性基因，设计合成5对寡核苷酸引物，应用PCR技术进行特异性检测。通过对多重PCR反应体系、条件进行优化，显著提高了检测灵敏度（在10～100CFU），用于水样分析中时，极大缩短了检测时间（仅需5～6h），结果重复性好，可推广应用于环境监测、水源监测等。此外，PCR技术还可以监测环境中特定微生物种群的动态变化和特异基因的表达情况。
三、发光细菌检测技术
1.发光细菌的分类
发光细菌（luminescent bacteria或luminousbacteria）为革兰阴性的兼性厌氧菌，大小为（0.4～1.0）μm×（1.0～2.5）μm，无孢子和荚膜，有一根或数根端生鞭毛，最适生长温度为20～30℃，适宜pH为6～9，适宜NaCl浓度为30g/L，3g/L的甘油对发光反应有利。目前发光细菌的分类普遍采用的是美国学者Baumann的方法（表11-1）。
表11-1 发光细菌的分类
2.发光细菌检测的原理
发光细菌法是利用灵敏的光电测量系统测定毒物对发光细菌发光强度的影响。毒物的毒性可以用EC50表示，即发光细菌发光强度降低50%时毒物的浓度。发光细菌含有荧光素、荧光酶、ATP等发光要素，在有氧条件下通过细胞内生化反应而产生微弱荧光。当细胞活性升高，处于积极分裂状态时，其ATP含量高，发光强度增强。发光细菌在毒物作用下，细胞活性降低，ATP含量水平下降，导致发光细菌发光强度降低（图11-1）。实验显示，毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系，因而可以根据发光细菌的发光强度来判断毒物毒性大小，用发光度表征毒物所在环境的急性毒性。
图11-1 发光细菌发光原理
共有3种酶参与发光反应，分别为FMN还原酶、荧光素酶（BL）和脂肪酸还原酶。
FMN还原酶（E.C.1.5.1.29）也称黄素还原酶、FMN∶NADH氧化还原酶，是一种以FMN为辅酶的还原酶，催化FMN还原为FMNH2，以NADH或NADPH为其氢供体。在发光反应中，通过该酶的催化作用为荧光素酶提供底物FMNH2（图11-1），其催化反应可概括如下：
H ++NADH+FMN→NAD ++FMNH2
发光细菌的FMN还原酶可以分为三类：还原酶P优先利用NADPH作为电子供体；还原酶D优先利用NADH作为电子供体；一般的黄素还原酶对NADH或者NADPH都不表现出特异性。FMN还原酶是单体酶，辅酶FMN以非共价的形式与酶结合。催化反应中FMN的功能部位是其异咯嗪环，能够充当双电子受体。不同微生物的FMN还原酶分子质量不尽相同，大致范围为24～28ku。
BL催化长链脂肪醛、FMNH2和O的氧化反应，发出蓝绿光（λ=490nm），反应原理表示如下：
FMNH2+RCHO+O2→FMN +RCOOH+H2O+hν
BL是杂二聚体，含α、β两个多肽亚基的单加氧酶。单独α亚基、β亚基均无发光活性，只有α、β共存时才有活性。从不同海洋细菌中提取到的BL的分子质量基本相同。其中，α亚基含354个氨基酸，分子质量约为40ku；β亚基含325个氨基酸，分子质量约为37ku。从陆生细菌中分离到的BL的α亚基含360个氨基酸，分子质量约为41ku；β亚基含327个氨基酸，分子质量约为38ku。陆生细菌的α亚基和β亚基氨基酸序列分别有85%和60%与海洋细菌同源。有研究表明，BL与黄素（flavin）的结合点在α亚基。通过基因重组及定点诱变发现，α亚基控制酶的催化能力和结构特点，亦是评判酶的热稳定性的关键因素。α-113位对酶与黄素的相互作用密切相关，α-227位在调整酶与底物醛的作用中处于中心位置。
和其他酶一样，BL活性受许多因素的影响：O2和离子浓度均能影响发光，H2O2、乙醛及长链烷基化合物在反应中刺激发光。从发光致病杆菌（Xenorhabdus luminescens）中提取的BL发现，酶与FMN相互作用；热稳定性研究发现，BL的热稳定性与其所表达的有机体有关，但与有机体细胞的抗热性无关，木糖醇、甘油加入培养基中可保护酶的活性。
3.发光细菌在环境污染检测中的应用
发光细菌技术已是一项非常成熟的技术方法，广泛应用于废水、污泥、土壤中污染物毒性检测，农产品及食品安全领域，化学品毒性评价，以及环境工程验收等方面；尤其在水毒性检测方面应用极广，我国于1995年将之作为水质急性毒性测定的国标方法（GB/T 15441—1995）。
（1）在工业废水毒性检测中的应用采用Microtox（发光细菌毒性检测）、虹鳟鱼和水蚤测定造纸厂废水的毒性，结果表明，发光细菌法的测试结果与虹鳟鱼的测试结果具有很好的相关性（r＞0.9），与水蚤的测试结果相关系数r＞0.8；总体上，发光细菌法的灵敏度高于虹鳟鱼，但低于水蚤。董玉瑛等利用发光细菌法对啤酒、酿造、印染、化纤、造纸等行业的废水的综合毒性进行了测定，结果表明，所测废水均对发光细菌呈现毒性效应，其中化纤黑液、化纤黏胶废水和造纸黑液的EC50分别为3.641%、4.844%、6.509%，毒性级别为强毒，属Ⅰ 级废水；啤酒、酿造、印染废水的EC50分别为38.923%、52.829%、34.005%，毒性级别为中毒，属Ⅱ级废水；化纤生化出水EC50为78.053%，毒性级别为微毒，属Ⅲ级废水，仍对发光细菌具有生物毒性，不能安全排放。因此，生化工业废水监测分析只采用理化方法是不全面的。
（2）区域水质监测吴伟等以明亮发光杆菌（Photosbacterium phosphoreum）作为指示物，对渔业水域污染物的急性毒性进行了监测，同时研究了pH、温度对试验结果的影响。研究发现，发光细菌毒性试验是一种快速、简便的毒性测试方法，在温度20～30℃、pH6～9条件下进行的测试，其结果与鱼类毒性试验可以相互替代。
（3）在土壤污染物毒性检测中的应用用明亮发光杆菌监测土壤中外源锗（Ge）对土壤微生物的毒理效应，发现Ge浓度与明亮发光杆菌发光度之间有极其显著的负相关性。按照发光强度80%和100%为临界值，计算得土壤中Ge的临界浓度分别为50.2mg/kg和5.8mg/kg。利用发光细菌法研究了土壤中水提取液中两种汽油（90#和93#）的生物毒性。提取液中的90#和93#汽油分别在63.2～90.1mg/L和62.7～91.1mg/L范围内有较高的生物毒性，并随浓度的升高而增强。90#和93#汽油的土坡水提取液EC50值分别为83.5mg/L和83.7mg/L，在土壤中的临界值分别为2308mg/kg和3678mg/kg。这些结果表明，发光细菌毒性测定方法可用于石油产品污染土壤的生物毒性评价方面。
（4）在农产品安全监测中的应用采用发光细菌对甲胺磷、水胺硫磷、氧化乐果、敌敌畏、辛硫磷、甲基异硫磷6种常用有机磷农药进行检测，结果表明，随着试样中有机磷农药浓度的增加，发光细菌的发光强度降低，发光强度与农药浓度呈负相关。发光细菌检测法的最小检出浓度为3mg/L。刘清等分别探讨了Cu、Zn、Cd、Hg 4种重金属对青海弧菌（Vibrio qinghaiensis，一种淡水发光菌）的单独和联合毒性效应。在单独污染中，发现青海弧菌对这些金属产生了毒性反应，Zn显示了最强毒性，Cd和Hg的毒性接近，Cu的毒性最低；在复合污染中，发现对青海弧菌的毒性，Zn和Cd有拮抗作用，Zn和Cu有加和作用，而Cu和Cd、Cu和Hg、Zn和Hg、Cd和Hg均为协同作用。江敏等研究了吲哚、吡啶、喹啉、异喹啉、2-甲基喹啉和8-羟基喹啉6种氮杂环化合物对发光细菌的急性毒性作用，及上述物质两两混合对发光细菌的联合毒性作用。结果表明，发光细菌的相对发光度均随化合物浓度的增加而线性降低，具有良好的相关性；其毒性由强至弱依次为8-羟基喹啉、异喹啉、吲哚、喹啉、2-甲基喹啉、吡啶，且所有物质两两混合的联合毒性作用均表现为相加作用。
（5）在化学品毒性监测中的应用利用发光细菌毒性测试技术，对5种多环芳烃化学物及其部分降解产物的生物毒性进行了检测和评价。结果表明，在二甲基亚砜配制的测试液中，萘、菲及荧蒽均对发光细菌具有一定的生物毒性，且相同浓度下毒性菲大于萘。测试液中当萘浓度小于其溶解度时即产生100%的抑光率，而菲及荧蒽浓度接近其溶解度时分别仅产生低于50%和15%左右的抑光率；芘及蒽在最大浓度时则对发光细菌无生物毒性显示，降解产物水杨酸、儿茶酚及邻苯二甲酸均对发光细菌具有一定生物毒性，但毒性均远小于母体化合物萘和菲，且邻苯二甲酸代谢途径对菲解毒的效果优于水杨酸代谢途径。说明多环芳烃化合物生物毒性的检测与其水溶性的大小密切相关，利用二甲基亚砜获取多环芳烃污染提取液的生物毒性主要与低分子质量多环芳烃萘及菲有关。低分子质量多环芳烃微生物降解后期解毒效果明显，但降解后期产物对发光细菌仍有一定毒性，且细菌不同的代谢途径中多环芳烃毒性降低的程度不同。
（6）发光细菌在项目工程验收中的应用 因为生物毒性试验既可以测定废水的综合毒性，也可以测定单一污染成分的毒性，能更客观地反映废水对生物的实际影响。厉以强等用发光细菌法检测了某化工项目竣工环境保护验收监测时废水的急性毒性。结果表明，达标排放的废水对生物的急性毒性为低毒，试验结果与常规验收监测结果有可比性。发光细菌毒性试验可用于必须公示的敏感项目竣工环境保护验收监测。
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