黄酮类化合物（flavonoids）广泛存在于大型真菌、蔬菜、水果、牧草和药用植物中，是生物在长期的自然选择中产生的一些次级代谢产物。目前已发现9000多种，根据分子结构的不同可以分为黄酮醇、黄烷酮、黄酮、异黄酮、儿茶酸、花青素等（图10-5）。具有抗氧化、抗衰老、抗癌、抗菌、抗病毒、预防肥胖和糖尿病、抗凝血、抗炎症、抗过敏等多种生理活性。黄酮类化合物几乎都有一个由15个碳原子组成的核心骨架，通过对核心骨架的烷化、氧化和糖基化等化学修饰作用可以形成种类众多的黄酮类物质。天然黄酮类化合物的研究主要集中于植物，在大型真菌有少量研究。目前，除了物质提取和生理活性等研究以外，采用代谢工程手段，构建生产黄酮类化合物的工程菌，实现工程化微生物生产该类物质的研究也较多。

图10-5 几种黄酮类化合物的化学结构

一、真菌黄酮类化合物的生理活性

植物中存在的黄酮类化合物的生理活性研究较多，而大型真菌该类物质的生理活性研究较少，且主要集中于抗氧化和抗肿瘤等研究。黄酮类提取物是一种很强的抗氧化剂，能够将活泼、有害的自由基还原为稳定、无害的产物，有效清除体内的氧自由基。大量研究表明，食用菌黄酮类化合物具有普遍的抗氧化活性。缪钱江等采用乙醇提取法提取了榆黄蘑（Pleurotus citrinopileatus）、秀珍菇（Pleurotus geesteranus）、黑木耳（Auricularia auricula）和平菇（Pleurotus ostreatus）等4种食用菌的总黄酮物质，并通过自由基清除法和铁还原法比较了总黄酮的抗氧化能力。结果表明，4种食用菌的总黄酮含量分别为1.33mg/g干粉、0.87mg/g干粉、0.64mg/g干粉和3.16mg/g干粉，提取物具有一定的抗氧化和抗肿瘤活性，平菇中黄酮的总抗氧化能力和抗肿瘤活性明显高于其他品种。长裙竹荪（Dictyophora indusiata）黄酮提取物有很好的还原性，对超氧阴离子、DPPH和羟自由基都有较好的清除能力，具有良好的抗氧化性。此外，从虫草花、鸡油菌（Cantharelluscibarius）、金针菇（Flammulina velutipes）、长白山美味牛肝菌（Boletus edulis）、桑黄（Phellinus sp.）等食用菌中提取的黄酮类化合物都表明具有明显的抗氧化性。40g/L的大球盖菇（Stropharia rugosoannulata）黄酮类化合物溶液对大肠杆菌和青霉菌有抑制作用，且对大肠杆菌的抑制作用要强于对青霉菌的抑制作用。桑黄总黄酮具有明显的降血脂作用。

二、微生物合成黄酮类化合物

目前工业生产黄酮类化合物主要是从不同的植物组分中提取。由于天然提取受到季节和工艺的限制，产品纯度不高且价格昂贵，因此通过代谢工程的手段改造微生物从而合成黄酮类骨架物质成为一种具有巨大潜力的生产方式。目前国际上以微生物生产黄酮类化合物的研究主要集中在生产黄酮骨架物质上。

1.黄酮类化合物的合成途径

微生物合成黄酮类化合物的途径见图10-6。苯丙氨酸（Phe）或酪氨酸（Tyr）在苯丙氨酸脱氨酶（PAL）或酪氨酸脱氨酶（TAL）作用下变为肉桂酸或香豆酸，肉桂酸在依赖细胞色素P450的4-肉桂酸羟化酶（C4H）作用下转化为香豆酸。TAL受到下游产物香豆酰-CoA的反馈抑制。依赖细胞色素P450的C4H需要锚定在内质网膜上，并且必须有还原剂随时将氧化态的P450还原才能表现出活性，因此很难在细菌细胞内表达出有活性的C4H。为了绕过C4H的活性限制，将来自天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）的香豆酸CoA连接酶（4CL）与来自深红类酵母的PAL和来自甘草的查尔酮合成酶（CHS）导入大肠杆菌表达，最终得到了较高的骨架物质产量。4CL可以同时作用于肉桂酸和香豆酸生成肉桂酰-CoA和香豆酰-CoA，因此可以绕开由苯丙氨酸合成黄酮骨架物质的限制。CHS将三分子丙二酰-CoA和一分子4-肉桂酰-CoA/4-香豆酰-CoA转化为生松素查尔酮/柚皮素查尔酮，最后在查尔酮异构酶（CHI）作用下，获得生松素/柚皮素，芪合酶（STS）以4-香豆酰-CoA为底物，结合三分子丙二酰-CoA合成白黎芦醇。柚皮素和生松素在依赖细胞色素P450的异黄酮合成酶（IFS）催化下转化为异黄酮，在黄酮合成酶（FSI）或者依赖细胞色素P450的黄酮合成酶（FSII）作用下转变为木樨草素和芹黄素。

2.以大肠杆菌为宿主合成黄酮类化合物

（1）模块化合成策略 根据功能不同，将合成黄酮类化合物相关的基因分为多个模块，对这些模块内基因的表达强度进行理性调节，有效地提高了骨架物质的产量。将合成Phe的相关基因aroFfbr和pheAfbr，合成肉桂酰-CoA的基因pal和4cl，由肉桂酰-CoA到生松素的chs和chi基因以及丙二酰-CoA的合成基因matB和matC分别组合为4个模块，根据启动子强度和质粒的拷贝数来确定每个模块基因的表达强度，最终得到生松素产量为40.02mg/L。应用同样的策略对白藜芦醇和柚皮素生产进行了模块化优化，得到产量分别为35.02mg/L和100.64mg/L。

图10-6 黄酮类化合物的合成途径

4HP3H—4-羟基苯乙酸酯-3-羟化酶ACC—乙酰-CoA羧化酶（1）R₁=R₂=OH，咖啡酰-CoA；(www.daowen.com)

R₁=R₂=H，肉桂酰-CoA；R₁=OH，R₂=H，香豆酰-CoA（2）R₁=R₂=OH，圣草酚-查尔酮；

R₁=R₂=H，生松素-查尔酮；R₁=OH，R₂=H，柚皮素-查尔酮（3）R₁=R₂=OH，白杨素；

R₁=R₂=H，芹黄素；R₁=OH，R₂=H，木犀草素（4）R₁=R₂=OH，圣草酚；R₁=R₂=H，

生松素；R₁=OH，R₂=H，柚皮素FSⅡ为依赖细胞色素P450的单氧化酶

（2）模型优化策略 构建了CiED（cipher of evolutionary design）模型预测工具预测敲除菌体的某些基因或者改变代谢网络后菌体的代谢变化，应用该工具使碳源尽可能流向乙酰-CoA和黄酮骨架物质合成的方向，使得柚皮素和圣草酚产量分别提高到100mg/（L·OD）和55mg/（L·OD）。利用OptForce工具预测出敲除fumC和sucC基因，同时过表达ACC、PGK、GAPD、PDH酶可以提高菌体内丙二酰-CoA的含量，使得菌体由香豆酸开始能够合成474mg/L的柚皮素。

（3）增加前体物质的策略咖啡酸、香豆酸和丙二酰-CoA是黄酮骨架物质的直接前体，添加或提高它们的产量可以有效增加黄酮骨架物质的合成。大肠杆菌的4-羟基苯乙酸酯-3-羟化酶（4HP3H）可以催化香豆酸合成咖啡酸，成功地绕开了细胞色素P450酶香豆酸-3-羟化酶（C3H）的限制，在酪氨酸高产菌株中获得了50.2mg/L的咖啡酸产量。随后在以香豆酸为底物的条件下获得了3.82g/L的产量，在Phe和Tyr均高产的菌株中得到766.68mg/L的产量。在高产酪氨酸大肠杆菌内以葡萄糖为底物得到974mg/L香豆酸、150mg/L咖啡酸。

细胞内较低的丙二酰-CoA含量是导致骨架物质产量较低的重要原因。将来自于谷氨酸棒状杆菌的乙酰-CoA羧化酶（ACC）置于表达质粒上，导入大肠杆菌，有效提高了黄酮产量。共表达来自发光光杆状菌（Photorhabdus luminescens）的ACC以及生物素连接酶，融合表达来自大肠杆菌和发光光杆状菌的生物素连接酶，增强菌体对乙酸盐的吸收能力。以Phe为底物使得生松素、柚皮素和圣草酚产量分别提高到429mg/L、119mg/L和52mg/L。随后他们发现导入三叶草根瘤菌（Rhizobium trifolii）的丙二酰-CoA合成途径以及利用浅蓝菌素来抑制脂肪酸代谢途径能再次提高骨架物质产量，在以Phe为底物的条件下生松素产量达到700mg/L。此外，通过筛选不同植物里的STS基因，利用不同的启动子、质粒结构和宿主来优化白黎芦醇途径，在添加了浅蓝菌素抑制脂肪酸合成的情况下产量提高到2.3g/L。

3.以酿酒酵母为宿主合成黄酮类化合物

以酿酒酵母为宿主可以表达出有活性的P450羟化酶（C4H）。合成黄酮类化合物的过程中有多个步骤涉及P450酶，因此酿酒酵母成了一个良好的生产菌种。用酿酒酵母为宿主，通过共表达PAL、4CL和CHS三种酶，在添加Phe/Tyr的条件下得到生松素和柚皮素的产量分别为0.8mg/L和7mg/L。在酿酒酵母共表达C4H、4CL、CHS和CHI四种酶，并以Phe为底物合成黄酮类物质，最终得到柚皮素、生松素和圣草酚的产量分别为28.3mg/L、16.3mg/L和6.5mg/L，进一步提高了产量。采用随机拼接构建人工酵母染色体的方法，以天然或非天然的底物生产黄酮类化合物，发明了一种构建全代谢路径工程菌的方法。用酿酒酵母还可以生产自然界中不存在的非天然黄酮类化合物。以22种肉桂酸衍生物为底物，用含有4CL、CHS酶的菌株生产非天然黄酮类物质获得了成功。

4.以委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuelae）为宿主合成黄酮类化合物

采用敲除苦霉素聚酮合酶的委内瑞拉链霉菌为宿主，共表达来自天蓝色链霉菌的4-香豆酸-CoA连接酶（4CL）、不同来源的CHS以及CHI，最终成功合成了黄酮骨架物质。随后，在委内瑞拉链霉菌中导入了matB和matC基因后，在外源添加丙二酸盐的条件下，有效地增加了黄酮类化合物的产量，柚皮素35.6mg/L、生松素44.1mg/L。