甾体类化合物在结构上具有环戊烷多氢菲的基本骨架，在母核上通常带有两个角甲基（C10、C13）和一个含有不同碳原子数的侧链或含氧基团如羟基、羰基等（C17）（图10-2）。甾体类化合物结构多样，种类众多，其中很多化合物如胆固醇、胆汁酸、性激素、维生素D、心脏苷配基、抗生素和昆虫蜕皮激素等在生命活动中扮演着至关重要的角色。甾体类化合物在医药领域中应用也非常广泛，主要用于抗炎、抗毒、抗过敏、抗休克等，能治疗或缓解胶原性疾病和过敏性休克，也可用于治疗阿狄森病等内分泌疾病，还是治疗乳腺癌和前列腺癌的重要辅助治疗药物。麦角甾醇为研究较多的微生物产甾体类化合物。此外，甾体类化合物的生物转化也一直是医药界的研究热点。

图10-2 甾体类化合物的基本骨架

R₁和R₂通常为甲基

一、麦角甾醇

麦角甾醇（ergosterol）又称麦角固醇，是脂溶性维生素D₂的前体，当受到紫外线照射时可转化为维生素D₂。麦角甾醇是一种重要的医药化工原料，可用于“可的松”“黄体酮”等药物的生产。麦角甾醇是真菌细胞膜的重要组分，它在确保膜结构的完整性、膜结合酶的活性、膜的流动性、细胞活力及物质运输等方面起着重要作用（表10-8）。麦角甾醇生物合成途径中的几个关键酶是抗真菌药物的作用靶位，对其生物合成的研究将为抗真菌药物的筛选及其作用机制的研究提供重要的理论基础。

表10-8 一些真菌麦角甾醇的含量（HPLC法测定）

续表

二、甾体类化合物的生物转化

随着对甾体类化合物研究的深入，甾体化合物的衍生物逐渐被发掘。诸多研究表明，通过化学合成或者生物转化的方法能够对甾体结构进行修饰，而甾体结构细小的变化都能够对其生物活性产生巨大的影响。相较于传统化学合成的方法，采用生物转化的方法引入特征官能团，以及修饰化合物的结构，更为有效且更加环保，成为相关药物开发的热点。

1.羟基化反应（hydroxylation）

甾体类化合物通过羟基化修饰在分子上引入羟基后，一般会影响其药理活性。常见的有机化学合成手段很难进行直接羟基化反应。然而在生物转化中，这种C—H键的羟基化是一种非常常见并且重要的生物转化反应。雌烷、孕烷、雄烷等具有甾体母核的化合物的微生物转化羟基化常出现在特定的位置。羟基化常是由根霉、曲霉、链霉菌等微生物实现的。甾体的羟基化衍生物是医药产品的一个重要组成部分，被广泛应用于癌症、炎症和HIV等多种疾病的治疗中。目前的研究主要侧重于11α、11β以及16α的羟基化，这三种微生物羟基化反应对于甾体类化合物的工业化，存在巨大的经济效益。通过微生物对甾体母核不同位点的羟基化，对甾体进行修饰，产生结构多样的甾体衍生物，同时能够改变甾体化合物的生物活性。

黄体酮也称孕酮，是由卵巢黄体分泌的一种天然孕激素，是重要的药物中间体。利用冻土毛霉（Mucor hiemalis）转化黄体酮获得三种产物：14α-羟基黄体酮、6β，14α-二羟基黄体酮和7α，14α-二羟基黄体酮，转化率高达94%，表明通过微生物转化黄体酮，可以产生多种具有工业开发潜力的羟基化黄体酮衍生物。同时，冻土毛霉也能够羟基化转化另一个甾体药物睾酮。睾酮又称睾丸素，能够维持肌肉、骨质强度，能够影响人体系统和功能。通过微生物转化，共获得4种羟基化产物：14α-羟基睾酮、7α，14α-二羟基睾酮、6β，14α-二羟基睾酮和14α-羟基-4-雄甾烯-3，17-二酮。此外，采用冻土毛霉M881菌株，在大规模生产中能将黄体酮进行6β，11α双羟基化，产生转化产物11α-羟基黄体酮、6β，11α-双羟基黄体酮和6β-羟基孕甾-4-烯-3，11，20-三酮（图10-3）。

图10-3 冻土毛霉M881羟基化转化孕酮的反应式

微生物转化通过对底物的修饰，获得重要的药物生产中间体或底物衍生物，在活性医药中间体发掘中具有重大意义，大量的发酵实验也表明了微生物在甾体类化合物大规模转化应用中的可行性。此外，通过结构的改变，也可阐明甾体结构和生物活性之间的关系。

2.羰基化反应（carbonylation）

羰基化反应又称加氢甲酰化反应，在甾体类化合物的生物转化中较少出现，并且在甾体类物质的生物转化过程中，羰基化反应往往伴随着羟基化反应。甲基雄烯酮是一种抑制睾酮分泌的合成代谢类固醇，能够通过刺激肌肉细胞活性，发挥促进肌肉细胞生长的作用。除了构建肌肉块作用外，甲基雄烯酮还可以增加身体的钙水平，帮助治疗骨质疏松症。采用丝状真菌菜豆壳球孢（Macrophomina phaseolina）对甲基雄烯酮进行生物转化，生成5种转化产物，其中两种为羰基化产物：17β-羟基-17α-甲基雄烷-1，4-二烯-3，6-二酮和17β-羟基-17α-甲基雄烷-1，4-二烯-3，11-二酮（图10-4），抗β-半乳糖苷酶活力实验发现，转化产物17β-羟基-17α-甲基雄烷-1，4-二烯-3，6-二酮具有明显的抗β-半乳糖苷酶活力。

图10-4 菜豆壳球孢羰基化转化甲基雄烯酮的反应式

3.氢化反应（hydrogenation）(www.daowen.com)

氢化反应是有机化合物与氢分子的反应，属于还原反应。在微生物转化中，具有羰基或者碳碳双键结构的底物能够在微生物的作用下发生加氢反应。微生物加氢能使酮基还原成羟基（主要是在C3、C17和C20三个位点上）；同时，甾体结构双键的氢化则通常发生在A环上的C 1、C2和C4、C5以及B环上的C5和C6双键的还原。这方面的生物转化研究不是太多，典型的例子有康复龙利用壳球孢菌、黑曲霉、匍枝根霉和镰刀霉的氢化转化、泼尼松龙采用玫瑰产色链霉菌（Streptomyces roseochromogenes）的微生物转化以及氢化可的松采用腐皮镰刀菌（Fusarium solani）和赭曲霉的微生物转化。

4.脱氢反应（dehydrogenation）

微生物对甾体进行脱氢反应经常发生在A环的C 1、C4和C5位之间，少数脱氢也可发生在羟基上。甾体类药物的脱氢有助于提高和改进药理活性，降低毒副作用。这方面的例子较多。采用刺孢小克银汉霉（Cunninghamella echinulata）转化剑麻皂素（替可吉宁）的过程中，出现了脱氢化和羟基化反应，获得了两种新型脱氢产物孕烷-3-氧-14α，16β，20-三醇和孕烷-3-氧-7β，16β，20-三醇；利用粉红单端孢（Trichotheciumroseum）生物转化替勃龙，发生了双键变换反应产生了Δ4-替龙，后经脱氢反应产生了脱氢反应产物Δ1，4-替龙。采用诺卡菌（Nocardia sp.）对胆固醇进行生物降解，胆固醇侧链降解生成4-雄烯-3，17-二酮，后经脱氢作用产生了最终降解产物1，4-雄二烯-3，17-二酮。

5.Baeyer-Villiger氧化反应和溴化反应

甾体类化合物经过Baeyer-Villiger氧化，可在羰基旁边插入氧原子，产生相应的甾体类内酯。甾体类内酯具有抗癌等多种生物活性，并且能够抑制5α-还原酶，阻断睾酮变成5α-二氢睾酮的路径，从而能够治疗雄激素依赖性疾病。甾体类内酯可抑制甾体芳香化酶，可用于治疗乳腺癌。溴化反应在甾体类物质的生物转化中较少出现，主要应用于降解有害物质。采用Penicillium lanosocoeruleum对多个C19甾体（雄甾酮、表雄甾酮、雄甾二酮和脱氢表雄酮等）进行微生物转化，经过氧化产生了多种酮和内酯产物。采用球孢白僵菌（Beauveria bassiana）对3α-二氢雄甾酮进行生物转化，在进行羟基化后还发生了氧化反应，生成了多种羟化氧化产物。采用淡水绿藻斜生栅列藻（Scenedesmus obliquus）对17α-炔雌醇进行了生物转化，超过68%的底物被绿藻所转化，生成溴化产物2，4-二溴-17α-炔雌醇。

三、甾体药物的微生物转化技术

甾体微生物转化的一个主要问题是底物和产物在水溶液中的溶解度很低，一般甾体、甾醇化合物在水中的溶解度通常低于0.1mmol/L或1μmol/L，而且底物会包埋在所析出的产物晶体中，影响底物与酶的有效接触，限制了最终产率。有研究表明，在微生物转化甾体的体系中，随着表面活性剂溶解度的增加，甾体的水溶解度增大。甾体类药物的微生物转化主要有如下几种技术。

1.双水相转化技术

该技术成相介质的选取至关重要，它直接影响到底物和产物在两相中的分配。在双水相体系中利用分枝杆菌进行胆固醇侧链降解制备雄甾-4-烯-3，17-二酮和雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮，采用聚乙二醇、葡聚糖及Brij35或聚乙烯吡咯烷、葡聚糖及Brij35组成的双水相体系，菌体在上层的聚乙二醇（富集）或聚乙烯吡咯烷（富集）相有较高的转化活力。采用双水相体系由简单节杆菌（Corynebacterium simplex）转化氢化可的松为泼尼松，细胞转化一定时间后可再生。为降低构建双水相的成本，可采用以淀粉为基质的多聚物Reppal-PES作为葡聚糖的替代物。

2.有机介质中微生物转化技术

有机介质中微生物转化技术的优点有：①利于简化产物分离工艺；②由于甾体化合物在有机介质中的溶解度与在水相中相比大大提高，因而可提高投料浓度；③可减少基质和产物对酶的抑制作用，从而提高转化率。有机介质中微生物转化技术主要包括水-有机溶剂两相反应体系与微乳化技术。两相体系的组成可以采用有机介质（水不溶性）/发酵液或有机介质（水不溶性）/缓冲液。在辛烷/发酵液（1∶1）组成的两相体系中采用脱氢黄杆菌（Flavobacterium dehyrogenans）由醋酸雄烯制备4-雄烯-3，17-二酮，采用发酵液作为第二相更有利于微生物转化，其原因在于发酵液利于辅酶的再生。在该体系中获得了高达98%的转化率，产物形成速率约是水介质中的6倍。在有机介质中结合细胞固定化技术进行甾体药物的微生物转化，有助于对生物催化剂进行保护，提高生物催化剂的使用性能。在癸醇或氯仿组成的两相体系中进行了不同细胞固定化方法的比较，发现在由癸醇构成的两相体系中结合采用聚氨基甲酸乙酯泡沫固定化对微生物酶活力的保留和对底物、产物的扩散较有利。微乳液是一种热力学稳定、光学透明、宏观均匀而微观不均匀的体系，它能提供酶催化所需要的大量油/水界面。生物催化剂增溶于油包水（W/O）微乳液中的纳米级“水池”中，可使生物催化剂以分子水平分散。同时，由于底物可以充分溶解在有机介质中，对于水难溶性底物有助于克服传质阻力。在磷脂、苯和少量水组成的微乳体系中进行高浓度16-甲基-莱氏化合物S-21醋酸酯C1，2位脱氢的研究，反应14～16h后，转化率达98%。

3.细胞固定化技术

采用固定化技术可以实现甾体药物的半连续化生产，利于生物催化剂与产物的分离以及细胞的重复使用，避免含酶细胞的频繁制备，减少了杂菌污染的机会。对甾体药物固定化细胞转化技术研究得最多和最有成效的是固定化活细胞包埋技术。常用的固定化载体有聚丙烯酰胺、聚氨基甲酸乙酯、海藻酸盐凝胶、二氧基硅氧烷、葡聚糖凝胶、聚乙烯醇等。此外，也有采用生物吸附法的报道。由于甾体化合物在水中的溶解度很低，采用疏水性固定化介质将更有利于水不溶性甾体底物与产物的扩散和传质。采用海藻酸盐共固定化生物催化剂（简单节杆菌）和底物（氢化可的松）进行C 1，2位脱氢反应，每个凝胶珠可以看成是一个小的反应器，由于缩短了扩散距离，转化率有所提高，反应结束后细胞可回收并重复使用。

4.磁化与超声波等物理方法的新应用

（1）磁化水处理 甾体微生物转化受众多物理因素的影响，把物理方法与生物化学方法相结合可取得一定的效果。磁场因子、磁化水与生长调节剂的配合使用以及磁化水处理绿僵菌对16α，17α-环氧黄体酮11α-羟基化的转化能力有明显改善，其效应与添加适量极性生长调节剂（主配方是硝基酚钠类一元酚的混合物，添加量为质量分数0.02%）时相当。两者配合使用有利于缩短发酵周期。磁化处理后菌种的优良特性可在传代中保持至第3代。

（2）超声处理 超声波应用于微生物的发酵过程中，可以在细胞表面瞬间造成微伤，使细胞壁局部破裂，从而改变细胞膜的通透性，使胞内物质释放或胞外物质进入细胞内，低功率时伤口很小，容易被自身修复，不会对生物体造成损伤或死亡。低功率超声加载于微生物的发酵过程中，不仅可加速细胞的生长，同时也可以促进有益次生代谢产物的产率。甾体微生物转化的底物可借助超声波处理从而提高底物的转化率。对于小分子固形物胆固醇作为底物的工业发酵，超声波处理所产生的搅拌作用和乳化作用使固形物在乳化体系中稳定分散，从而有效地提高了底物利用率。