自然环境中蕴含着丰富的微生物资源。采用传统的微生物分离培养技术仅能够认识自然界大约1%的微生物资源，因而还存在大量微生物资源等待着人类开发利用。在食品工业领域，微生物发挥着举足轻重的作用。一方面微生物是创造价值的基础，在酿酒、发酵食品制造等方面起着关键性作用；另一方面，腐败微生物滋生、病原微生物的出现导致食品质量安全隐患，给食品工业造成巨大损失。随着现代分子生态学的发展，打破了传统微生物分离培养方法的限制，可以不经人工培养直接对微生物进行研究。其中，宏基因组学技术在食品微生物资源开发利用、食品营养和食品安全等方面发挥着重要的作用。

一、宏基因组学的研究策略

宏基因组学（Metagenomics）又称元基因组学、环境微生物基因组学。宏基因组学以环境中全部微小生物体遗传物质的总和（主要针对环境样品中细菌和真菌基因组的总和）为研究对象，基于非传统培养的方法，借助高通量测序技术和生物信息学工具，通过基因筛选和序列分析等手段，来研究环境微生物的功能活性、多样性、种群结构、进化关系，以及它们与环境之间的关系。在宏基因组学研究中，能够发现大量不可培养的微生物、丰度相对低的种属以及新的功能基因或新基因簇，为全面阐释微生物群落结构以及群落代谢特征提供了有力的工具。功能宏基因组学技术对开发具有应用潜力的新基因、新酶和生物活性物质等具有重要意义，可极大地拓展微生物基因资源的利用空间，研究其功能和彼此之间的关系和相互作用，并揭示其内在规律。近年来，随着新一代测序技术的出现及基因组测序成本的降低，宏基因组学研究呈现出快速发展的趋势，并在食品工业领域发挥着越来越重要的作用，在新工业用酶开发、食品微生物研究、食品快速检测及生物活性物质的筛选等方面均都具有广阔的应用前景。针对食品工业的宏基因组学研究策略可分为食品微生物富集培养、富集样品宏基因组DNA提取、宏基因组文库构建及功能筛选等（图9-7）。

图9-7 食品工业宏基因组学研究策略示意

1.食品微生物的预富集

多数自然食品样品存在微生物数量少、基因丰度低等方面的问题，影响微生物核酸提取、文库构建等后续分子生物学操作，因此需要对样品进行预富集。预富集的方法包括细胞水平和基因水平的预富集。（a）细胞水平预富集：是根据细胞大小等一些物理、化学特性或者选择培养基对样品进行预富集，可以增加获得目的基因的概率。采用底物选择的方法包括改变常规培养基的成分，以达到富集样品特定微生物的目的。例如，将常规培养基中的葡萄糖改为羧甲基纤维素或橄榄油，可以富集样品中产生纤维素酶或脂肪酶、酯酶的微生物。还可以采用营养选择（碳源、氮源、氧源等）或物理化学指标选择（体积、搅拌、温度、pH等）等原理预富集。要注意的是，这样的预富集往往只能富集到生长速度快的类群，容易丢失其他大部分菌群的信息。（b）基因水平预富集：是指利用多种技术，从样品中筛选出所需基因作为模板，或筛选目标化合物从而构建文库。这种方法的优势在于不需要知道样品中菌群的种类和特性，减少预富集的难度，且目的性明确。稳定同位素探针技术向样品中添加经同位素标记的核酸，利用密度梯度离心进行分离，被标记的核酸即可用来构建文库，研究参与代谢过程的功能微生物群落结构。

2.样品总DNA的提取

食品工业中，样品一般比较复杂，选择适当的提取方法对高质量DNA的提取和后续的文库构建具有重要的作用。宏基因组DNA的提取方法可以分为直接提取法和间接提取法两类。直接提取法又称为原位提取法，是指样品不进行预富集而直接破碎微生物细胞获取DNA并进行纯化的方法。间接提取法又称为异位提取法，是用物理方法把食品工业中的微生物从样品中分离出来（预富集），然后用较温和的方法进行总DNA提取。直接提取法就是将样品悬浮于裂解缓冲液中处理，然后抽提纯化。此法的特点是易操作，成本低，DNA提取率高，但所提DNA片段较小（10～50kb）。间接提取法可获得大片段DNA（20～500kb），特点基本与原位提取法相反：所提DNA纯度较高，但操作繁琐，成本高，仍有些微生物在分离过程中可能会丢失。在实验过程中采用哪一种实验方法具体取决于实验所需要目的基因的大小和研究目的。

3.宏基因组文库的构建

研究目标不同，选择构建文库的载体和宿主细胞也不尽相同。载体的选择主要考虑目的基因的插入、表达等影响目的基因质量和表达量的因素。常用的载体包括质粒（插入小片段）、考斯质粒、细菌/酵母人工染色体（BAC或YAC）、噬菌粒载体等。小插入量文库载体如质粒和噬菌体载体，用于单个基因和小型操纵子的筛选，可筛选出酯酶、淀粉酶、磷酸酶、双加氧酶、蛋白酶、木聚糖酶、氧合酶、芳香烃分解酶、醛糖还原酶、乙醇氧化还原酶、酰胺酶和β-内酰胺酶等。大插入量文库载体如细菌人工染色体（高于40kb，一般100kb以上甚至达到200kb）、黏粒、柯斯质粒（均可达到40kb），常用来重新恢复期望基因组或大型DNA片段的复杂提取途径。细菌人工染色体广泛用于淀粉酶、抗菌物质等大片段基因插入。

宿主菌株的选择主要考虑转化效率、载体在宿主细胞内的稳定性、宿主为相关基因提供必需的转录表达体系的能力、对异源表达基因产物的相容性、目标功能性状及缺陷型等因素。目前，构建宏基因组文库最常用的宿主就是操作简单、繁殖迅速、培养代谢易于控制的大肠杆菌，不仅适用于淀粉酶、磷酸酶等常用物质筛选表达，还成功表达了羟基丁酸、羰基产物和抗菌产物等。其次，变铅青链霉菌（Streptomyces lividans）和恶臭假单胞杆菌（Pseudomonas putida）主要用于抗生素的鉴定。

4.序列筛选和功能筛选

宏基因组文库需要通过高通量和高灵敏度的方法筛选和鉴定文库中的有用基因。筛选技术大致可以分为基于核酸序列的差异分析筛选（序列筛选）和基于克隆子的特殊代谢活性筛选（功能筛选）。序列筛选是利用杂交探针技术筛选基因组文库中的目的基因保守序列，获取目的基因。该方法针对性强、效率高，但所得基因只是片段而非全长基因，而且难以得到新功能基因。现已筛选出聚酮合成酶和缩氨聚合酶，用于复杂的抗生素合成。另外还有1，2-苯甲酸盐双氧化酶、硫化氧合还原酶、烷烃羟化酶、4-氯苯甲酰基辅酶A脱卤素酶、亚硝酸还原酶、一氧化二氮还原酶、甲基卤化转移酶、氧化还原酶等。虽然新的高通量测序技术促进了环境微生物多样性的研究，但从宏基因组文库获得新基因的能力反而很容易受到复杂的微生物群体的制约。所以在实验之前必须对相关基因序列进行一定程度的了解。

功能筛选是对表达特殊功能的克隆进行选择性筛选，能获得全基因或新基因，但其时间长、工作量大，外源基因表达量低导致难以观察可见性状，且蛋白活性容易丢失。用此方法除可筛选出抗菌素耐药性基因、酯酶、脂肪酶、膜蛋白质、几丁质酶、4-羟基丁酸的基因编码酶等常用常见物质以外，还用于合成生物素研究，及用于抗生素、重金属等有毒化合物的降解研究。此法的限制性在于许多基因在宿主菌株（如大肠杆菌）里表达不明显，所以有待开发新宿主和更高的表达效率。

5.测序及分析

高通量测序技术打破了传统测序技术的限制，具有通量高、成本低等特点。目前常用的测序技术包括第二代高通量测序和第三代单分子测序技术。高通量测序是目前最常用的测序技术，IluminaSolexa是应用最多的测序平台。宏基因组学测序后都要进行生物信息分析。常用的有用于进化分析的MEGA、大规模平行信号测序系统MPSS、用于转录组基因标注的SEED等。分析工具有MG-RAST和SILVASSUref数据库，用于分类分析的MG-RAST和用于蛋白相似性分析的BLAT、M5 NR蛋白数据库。高通量测序技术虽然降低了测序成本、缩短了测序时间并提高了准确率，但是，相比于一般的研究，大量宏基因组学和元转录组学序列测定，仍然需要考虑研究成本问题。此外，由于宏基因组学研究起步较晚，可共享的数据库也不完善，对测序后获得的大量数据进行分析也有困难。

二、宏基因组学技术在食品工业中的应用

宏基因组学技术在食品工业中主要应用于食品微生物多样性研究、新型活性物质开发、有害微生物分析等食品微生物研究，以及有害物质的降解和食品营养等方面的研究。将宏基因组学技术应用于食品工业，有利于新食品技术开发的新型微生物活性物质（现阶段的主要目标为新型生物催化剂、新型微生物种类、基因和酶、抗生物质、产甲烷生物等）开发，或对食品质量有影响的食品新微生物资源开发，以及深入开展人体营养的探究，对危害食品安全的各个途径的分析，从而在各方面降低安全风险。另外，传统的细菌培养耗费人力物力，将宏基因组学技术运用于食品检测和食品研究中会带来更多便捷。(www.daowen.com)

1.开发食品微生物新基因

传统的微生物菌种筛选依赖于纯培养技术，包括微生物的分离纯化、扩大培养、活性检测和获得有益菌种后的开发利用。然而，基于人工培养的技术难以完全再现微生物的自然生存环境，而且只能开发极少数可人工培养的微生物资源。目前人们研究和利用的基因大都来自可培养的微生物，对环境中大量未培养微生物的基因资源开发方兴未艾。这些宏基因组文库包含的未培养微生物的遗传信息序列与已知的基因序列可能相似性很低。因此，宏基因组学提供了一个比传统培养技术更加快速、实用的方法，从构建的宏基因组文库分离鉴定出大量的新基因。已发现的新基因有生物催化基因、抗生素抗性基因等。发现新基因的方法依赖于高通量测序，然后对基因序列进行遴选。对于通过分子克隆、基因芯片等方法筛选出来的功能基因，可以根据其基因序列选择适合的酶进行酶切。对于未知的基因，要先采用不同的酶尝试酶切，然后再与载体相连接，并再次验证其功能。

2.开发食品工业酶制剂

酶是一类专一、高效，由活细胞产生并且需要一定的条件才能发挥作用的催化剂，在食品工业生产中使用广泛。多糖修饰酶如α-淀粉酶、淀粉脱支酶、葡萄糖淀粉酶等在食品工业生产中可用于转化原材料。蛋白酶、糖苷酶、淀粉酶、脂肪酶等已经成功商业化。微生物中丰富的基因资源蕴藏着大量已知或未知酶的功能基因。宏基因组学技术的应用可促进这些酶资源的开发和利用。通过宏基因组学技术，可以发现许多新功能基因及基因簇；把这些新功能基因和基因簇进行重组表达，就可以获得很多新型酶制剂产品。例如，从乳牛瘤胃中筛选出来具有潜在工业应用的多功能糖基水解酶；揭示琥珀酸丝状杆菌（Fibrobacter succinogenes）和白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus）等在沼气反应中表现出强大的生物降解木质纤维素的功能；从土壤宏基因组文库中筛选碱性蛋白酶，在脱脂牛乳平板上分析其宏基因组DNA插入，筛选到一个金属蛋白酶；从深海沉积物的宏基因组文库中筛选出脂肪分解酶；通过构建湖羊瘤胃未培养微生物的宏基因组文库，筛选其中新的木聚糖酶基因，建立一个瘤胃来源的木聚糖酶库，构建高效分解木聚糖的工程菌，从而降低了木聚糖酶的生产成本，提高了其应用适应性；从水牛瘤胃未培养微生物宏基因组文库中克隆并鉴定出β-葡萄糖苷酶基因，在同步糖化共发酵工艺生产酒精中有潜在的应用价值；用于消化生态系统研究，发现瘤胃细菌的新型水解酶基因，开发利用β-葡聚糖酶。此外，通过宏基因组学技术发现的一些高活力新型酶制剂包括乙醇氧化还原酶、酰胺酶、淀粉酶、4-羟基丁酸脱氢酶、脂肪酶、蛋白酶、聚乙酰合酶、几丁质酶、L-氨基酸氧化酶和羟化酶等。这些高活力新型酶制剂在食品产业领域具有非常大的应用潜力和价值。

3.研究食品营养

人体内微生物达数百万亿之多，可以编码比人体多100倍的独特基因，了解对人类健康有重要影响的肠道微生物非常重要。针对与人类健康密切相关的胃肠道环境的微生态平衡调节机制及失衡条件下发病机制的研究，属于环境宏基因组学的研究范畴。胃肠道是一个庞大且复杂的微生物生态系统，与人体健康密切相关，其中蕴含着丰富的微生物基因资源。研究这些基因，有助于探究人类肠道微生物功能，改善人体健康状况。利用宏基因组学技术分析了来自美国、日本、欧洲等124个人的粪便样品，发现50%的人群共享着75种微生物，90%的人群共享着其中的57种。人类肠道微生物群是有限的并且不能过大。通过Illumina测序平台对人类粪便样本进行宏基因组学测序，发现即使是最小肠道的宏基因组也富含着各种功能基因片段，可能对肠道健康起着重要的作用。肠道宏基因组是人类基因组的150倍，而且超过99%来自于细菌。研究了不同肠道环境下、参与不同物质循环的微生物群落，发现肠道微生物的主要功能是参与碳水化合物代谢、能量生成及细胞成分的合成，但没有理想揭示氨基酸和脂类代谢。这些研究结果对健康机体肠道微生物的功能有了新的认识。人群膳食与人体肠道微生物菌群结构紧密相关。一组对成人和断乳儿童的结肠微生物宏基因组学分析显示，膳食因素和人体各种状态，包括先天免疫和适应性免疫、对感染的相对敏感性、免疫耐受、营养素的生物利用度、肠屏障功能等，可能会改变肠道微生物群落的组成和功能。针对此状况，可采用合理调配的抗生素和益生菌来改善肠道的不良状况。肠道中的共生细菌代谢可作为能量来源的食品组分，而这些组分也能影响肠道细菌群落的组成。例如，十字花科食物中的硫化合物、多酚等植物化学物质和多不饱和脂肪酸，它们的生物利用度依赖于肠道菌群的利用，但又会对肠道菌群产生一定影响。

4.优化改造食品新工艺

许多食品产业的工艺流程均涉及微生物参与的关键制作环节。微生物的群落结构组成以及不同部位不同阶段的消长规律，复杂过程中的复杂微生物群落代谢调控网络，是目前有待探索的领域。利用宏基因组学技术可以方便、准确和快速地对其中的微生物多样性组成进行系统分析，获得有关微生物在不同环境中种类和数量分布的基础数据。在此基础上优化改造，发展新的食品制作工艺，提高生产效率和经济效益，以实现用生物技术改造传统产业的目的。

在前期微生物群落结构研究的基础上，通过宏基因组学和功能基因组学的研究可以为复杂的食品发酵过程建立一个基因组规模的发酵控制模型，通过该模型模拟预测食品发酵过程的变化，建立可控的食品发酵工艺。然而仅通过宏基因组序列和数学模型建立的发酵控制模型控制是远远不够的，还需要体外微生物的生理学研究来确认某些预测的代谢途径是否存在活性，二者结合才能建立一个高质量并能有效进行控制的发酵模型。利用宏基因组学技术研究意大利传统香醋中酵母菌群落的结构及功能具有很大优势，它可以完整地获得香醋发酵过程中全部酵母菌的信息，并从中掌握体系中不可培养或难以培养的酵母菌，在此基础上可局部构建全部酵母群落的代谢网络，以期从代谢角度阐述传统香醋中酵母菌的群落功能，为阐释传统香醋的醋酸发酵过程提供了坚实的理论基础。

5.研究食品安全问题

食品安全是当今世界人们所关注的焦点问题之一。由微生物病原体引起的食物中毒是最重要的食品卫生问题。传统的食源性致病菌诊断方法通常包括细菌的分离培养、染色、生化鉴定和血清学检测等步骤，操作繁琐，检验时间较长。此外，当食源性致病菌在环境中进入“活着但是不能培养”状态时，就难以检出和鉴定。宏基因组学技术可以避免传统检测方法的局限性，快速、灵敏、特异性高，可以对病原菌进行准确溯源，从而找出关键控制点，有效控制污染源并防止病菌的继续传播，确保食品的质量与安全。

同时，随着人类工业化发展，生态系统发生了巨大的变化，并从各个方面影响着人们的生活。工业废水污染着河流和土壤，污染物及其代谢产物以不同的形式随作物生长，经生物富集作用逐渐渗透入人体内，产生不同的食品安全和卫生问题。揭示这些问题，必须加强微生物生态群落环节的研究。宏基因组学技术应用于酰胺类除草剂降解、有机磷降解以及多环芳烃降解等研究，降低了农作物或者水体动物从环境中吸收有害因素进而危害人体的可能性。根据有机磷降解酶基因保守区设计引物，可从宏基因组文库中扩增有机磷降解酶基因片段。从宏基因组文库筛选出利用甲醇作碳源的微生物种群，为酿酒工业的安全生产提供了一些启发。采用宏基因组学技术研究筛选卤醇脱卤酶，可催化环境中有害的有机卤化物分解。

6.研究食品微生物多样性

宏基因组学研究的目的之一在于深入理解特定群落的动态关系和特殊环境各种物质的相互作用。用宏基因组学方法获取完整微生物群落基因，有效构建群落基因文库。特定环境微生物群落的组成和结构变化不是随机的，而是微生物之间通过相互作用而适应环境条件的有机组合，选择因子包括物理、化学和生物因素（竞争、捕食和共栖）等。用传统方法研究微生物之间的相互作用一般只局限于两种已经分离到的微生物，通过共培养，来推测其相互影响，难以建立多个种之间的关系。而宏基因组学信息可以提供主要菌群的代谢特征，以重建重要菌群的代谢过程和在系统中的作用，进而认知各菌群间的相互关系。

发酵食品因其特殊的风味广受大家欢迎。传统发酵食品包括食醋、酱油、豆豉、豆酱、泡菜等调味品，其发酵过程由多种复杂微生物参与，大多为自发的多菌种固态发酵形式，其中很多微生物是益生菌，会产生有益于人体健康的益生因子或者活性物质；但也有些微生物会产生生物胺、氨基甲酸乙酯等有害物质，可对人体健康造成一定的威胁。因此，需要了解食品发酵生产过程中微生物群落的组成、变化及其功能，从而实现对传统工艺的监控和标准化，并保障传统发酵食品的质量安全。利用宏基因组学技术、定量PCR技术和代谢组学技术对韩国泡菜发酵过程中微生物群落的变化、代谢物变化以及微生物群落基因特征和功能进行研究，揭示发酵过程中的优势微生物种群以及微生物群落变化规律，并揭示了一种与异源乳酸发酵有关的基因，表明发酵过程中基因功能以异养乳酸发酵相关途径为主。除了发酵过程中的有益菌之外，还检测到大量的噬菌体，表明发酵过程中存在大量的噬菌体侵染细菌。通过宏基因组学技术对发酵食品中存在的病毒群落进行了研究，利用高通量焦磷酸测序技术揭示了发酵过程中存在的主要病毒群落。虽然发酵食品中病毒群落相对简单，但是携带有噬菌体的发酵食品进入人体肠道是否会对人体健康产生危害尚待进一步研究。此外，借助宏基因组技术分离纯化大曲酒微生物分泌的功能酶，发现大曲酒发酵生产用微生物的新的功能酶类；筛选出的脂肪酶通过减少不饱和脂肪酸来达到加强其深度发酵的目的。宏基因组学技术产出大量的环境基因序列，使得揭示复杂环境微生物群落的系统组成成为可能。

三、宏基因组学在食品工业的研究展望

宏基因组学克服了传统培养方法开发利用微生物资源的局限性，更大程度地揭示了自然群体的生物多样性。此外，微生物功能可以从微生物群落所拥有的功能基因及其表达、微生物活性等方面来表征。从环境中直接提取DNA进行宏基因组测序分析，可以发现微生物群落中物质代谢的相关基因，从而推测微生物群体共同参与的物质代谢通路。目前，宏基因组学技术已经筛选获得了大量新型基因和活性物质，从中还可以开发更多促进食品工业原料应用的新型酶制剂和新的生物活性物质。宏基因组学技术已经应用于一些食品行业，对于食品微生物研究、食品快速检测及食品安全系统分析等有着长远的利用价值。环境中存在的各类微生物通过不同的方式进入食品之中。相信采用宏基因组学的技术方法，能确定对人类有影响但还未确定的致病因子。当然，宏基因组学技术仍处于发展阶段，作为一项年轻的生物技术手段还有许多亟待解决的问题，如文库的筛选方法有待进一步朝更敏感、更高通量方向完善；更新、更合适的载体还有待继续开发；以质粒为载体的文库受限于所能包容的插入尺寸，所以难以捕获染色体上的多基因；文库表达的宿主会影响筛选结果；由于异源基因不能被宿主的转录机制识别，筛选时就不能表达进而不能富集等。