国以民为本，民以食为天，食以安为先。我国非常重视食品安全。目前我国食品安全相关的法律有：《中华人民共和国食品安全法》《中华人民共和国农产品质量安全法》《中华人民共和国农业法》《中华人民共和国进出境动植物检疫法》《中华人民共和国进出口商品检验法（修正）》《中华人民共和国动物防疫法》《中华人民共和国消费者权益保护法》《中华人民共和国产品质量法》《中华人民共和国标准化法》《中华人民共和国国境卫生检疫法》《中华人民共和国渔业法》。相关的法规和部门规章更多。
食品是微生物生长繁殖的良好基质，在种植、加工、流通和消费等环节都可能存在微生物污染问题。在发展中国家，腹泻疾病频发，如20世纪90年代出现的弯曲杆菌，现在已经是引起腹泻的重要致病因子。所以食品微生物的监控极其重要，应贯穿从生产到消费的全过程，检测产品应具有快速、准确、灵敏、低廉等特点。
食品微生物常规检测项目有细菌总数、大肠菌群（coliform bacteria）、大肠杆菌（Escherichia coli）、酵母菌总数和霉菌总数等，致病微生物检测项目有沙门菌（Salmonellaspp.）、李斯特菌（Listeria spp.）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌O157：H7、弯曲杆菌（Campylobacter spp.）、致病弧菌（Vibrio spp.）、副溶血弧菌（V.parahemolyticus）、志贺菌（Shigella spp.）、假单胞菌等。国标GB/T 4789.1～40食品卫生微生物学检验的指标有：菌落总数测定、大肠菌群计数、沙门菌检验、志贺菌检验、致泄大肠埃希菌检验、副溶血性弧菌检验、小肠结肠炎耶尔森菌（Yersinia enterocolitica）检验、空肠弯曲菌（C.jejuni）检验、金黄色葡萄球菌检验、溶血性链球菌（hemolyticstreptococcus）检验、肉毒梭菌（Clostridium botulinum）及肉毒毒素检验、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringen）检验、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）检验、霉菌和酵母菌计数、常见产毒霉菌的鉴定、椰毒假单胞菌酵母亚种（P.cocovenenans subtype Farino fermentans）检验、单核细胞增生李斯特菌（L.monocytogens）检验、肠杆菌科噬菌体检验、大肠菌群快速测定、双歧杆菌（Bifidobacterium spp.）检验、乳酸菌（lactic acid bacteria）检验、大肠埃希菌O157：H7/NM检验、阪崎肠杆菌（Bntorobater sakazakii）检验等。
日益严峻的食品安全局势，要求我国食品微生物检测要提高效率，节约人力资源成本，在方法上与国际接轨。对于食品生产企业来讲，市场销售环节要求快速出货，尤其是一些保质期较短的产品；减少物流的压力，尽可能减少仓储，加快资金周转；节约人力资源成本（外资企业尤其突出）。对于运行HACCP质量保证体系的企业来说，快速检测方法尤其重要：可以快速检测原料及半成品的污染情况，以采取相应的措施控制最终产品的微生物超标情况。因此，研究和应用食品微生物的快速检测方法势在必行。国外许多政府检测机构都在大量使用快速检测方法，尤其是ATP法、免疫法、阻抗法和显色培养基法在国外应用相当成功。国内的许多政府检测机构也都已经在使用或正在考虑使用国外先进的快速检测技术。从长远发展趋势来说，快速方法是微生物检测的重要方向。
一、常规微生物快速检测技术
传统的微生物检测技术有平板倾注法、平板涂布法和最大或然数（most probable number，MPN）法等。这些方法可以定量检测食品微生物，但其检测前期都需要预增菌，后期需生化鉴定、血清学分析等鉴定实验，鉴定时间需要3～7d，且需要专业人员操作，容易造成假阴性或假阳性结果等。
1.传统计数改良法
对传统计数方法进行改良，可以减少人工操作，提高检测的精确度，降低假阴性或假阳性结果。主要的改良方法有螺旋平板计数法、滤膜法、纸片法、Simplate即用胶法等。
（1）螺旋平板计数法 该法使用螺旋接种仪将样品接种在平板上。样品接种后，菌落即分布在螺旋轨迹上，随半径的增加分布得越来越稀。采用自动菌落计数仪，通过特殊的计数栅格，自平板外周向中央对平皿上的菌落进行计数，即可得到样品中微生物的数量（图9-2）。与传统方法相比，该法的优点是无需稀释3个梯度，每个梯度倒2个平板，节省了大量人力物力。缺点是并没有缩短检测时间，菌落总数仍需要培养48h；而且需要配合自动菌落计数仪，否则人工计数更麻烦。
图9-2 螺旋平板计数法使用的螺旋平板接种仪和自动菌落计数仪
（2）滤膜法采用有1600个疏水网格、孔径为0.45μm的疏水性滤膜过滤液体样品，当液体样品通过滤膜时，微生物就会被截留在膜的表面。将滤膜放在装有培养基的平皿中培养，微生物在膜表面生长并形成菌落。该技术的主要优势有：可以对大量的样品进行浓缩，尤其适用于许多工业或环境微生物的分析；准备时间短；能够滤除抑制性或杀生物的试剂，因而增加了灵敏度；菌落无扩散情况，便于计数。缺点是需要额外的支出购买真空泵、多联支架及一次性滤膜；如果抽滤过程中空气洁净度不够，有可能造成二次污染，尤其是对菌数要求特别严格的产品，如啤酒、澄清果汁、桶装饮用水等。此类技术的商业化产品有美国Neogen公司的ISO-GRID/NEO-GRID、美国Pall公司的MicroFunnel一次性过滤漏斗等。
（3）纸片法 纸片法是皿膜法的代表，是目前被广泛接受的方法。国标餐具大肠菌群检测采用的就是纸片法。将显色培养基固定于纸片上，上方再盖一层带有方格的透明薄膜，以方便计数（图9-3）。该法的关键技术及难点为显色培养基和冷水可溶性凝胶的研究。显色培养基决定了试纸法检测的灵敏度、假阳性和假阴性等重要检测指标；冷水可溶性凝胶决定样品的凝胶速度、菌落大小等指标，直接影响菌落数的读取和结果的判读。该法的优点是无需制备培养基，携带方便，非漫延菌落计数较方便。缺点是不能节省检测时间（仍需人工培养增菌）；检测成本相对偏高；大肠菌群纸片存在与MPN法无法对应的问题，金黄色葡萄球菌纸片存在取样量太低的问题。目前仅细菌总数纸片有一些用户。
图9-3 纸片的结构示意及纸片法检测结果
（4）改良MPN法将细菌生长的营养物质与某种病原细菌特异性酶的底物配制成即用培养基，目的检测细菌生长繁殖后，表达出特异性酶活力，与特异性底物作用生成在紫外光下可产生荧光的物质，样品增菌后，在紫外灯照射下记录培养皿内能发出蓝色荧光的阳性池数，进而由最大近似值（MPN）表查出细菌的MPN。阳性池数与MPN呈松泊分布。
①SimPlateTMTPC法：基于食源性细菌的特异性酶类，TPC培养基内含有多种细菌酶类所对应的底物。检样被细菌污染时，只要具有一种酶的活性即能与底物作用生成4-甲基伞形酮，培养24h后，在紫外线照射下，发出蓝色荧光。食源性细菌悬浮于TPC培养基表面，在分隔的小池内能迅速进行生化反应，若有检样颗粒亦无干扰；它不是由48h形成的菌落来计数，而是24h后在紫外灯照射下记录培养皿内能发出蓝色荧光的阳性池数，进而由MPN表查出细菌的MPN。
②colilert法：采用大肠菌群细菌能产生D-半乳糖苷酶分解ONPG（邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷）使培养液呈黄色，以及大肠埃希菌产生D-葡萄糖醛酸酶分解MUG（4-甲基伞形酮-D-葡萄糖醛酸苷）使培养液在波长366nm紫外光下产生荧光的原理，来判断水样中是否含有大肠菌群及大肠埃希菌。只需24h即可同时定量出水样中大肠菌群和大肠埃希菌的MPN值。
2.微生物快速检测新方法
（1）基于微生物生长特征的快速检测技术
①ATP生物荧光法：ATP存在于所有生物细胞，可来源于细菌、酵母、霉菌、生物膜、组织残留等。食品加工过程采集的样品存在ATP，表明人接触了设备或器具、设备或器具被污染、清洗不正常、发生了非正常的敏感物污染或样品被微生物污染。ATP生物荧光法用于检测微生物的原理是：细菌ATP以自由的可溶解状态释放出来，在有荧光素酶、镁、氧气存在的条件下与虫荧光素发生反应产生荧光，发光强度与样品中ATP的含量成比例。该方法可用于食品、化妆品和药品企业对生产线和管道进行快速清洁程度检测，改良后可用于食品、化妆品的商业无菌检测或终产品检验。
目前，基于ATP原理的用于成品检测的微生物检测系统有三种：Charm LUM-96（用于高温瞬间灭菌产品的检测）、Celsis（主要用于化妆品检测）和Millipore公司的MicroStar。LUM-96通常用于进行商业无菌检测，可大大缩短库存时间，减少物流压力和成本。该类方法的缺点是，需要消耗大量的较昂贵的试剂，对仪器的清洗保养要求特别高。另外，特别是用ATP单个检测代替常规微生物和致病微生物检测，如果保温增菌时间不够，菌数未达到一定数量；取样量太小；或者由于培养基原因，目标致病菌未大量增菌等原因，会存在假阴性的风险。Millipore公司最新推出的MicroStar检测系统，为结合了生物荧光、膜过滤及CCD荧光照相检测等技术的新型检测系统。可过滤样品经膜过滤后，将菌截留在特殊的滤膜上，滤膜放置在培养基表面增菌后取出，加ATP释放剂，然后加荧光素和荧光素酶，显示的荧光信号在荧光显微镜或荧光检测器下观察并计数。该系统的优点是缩短了培养时间，提高了灵敏度，适合于菌数较低的可过滤产品使用；缺点为仪器昂贵，运行成本较高，不能用于检测未知的可能菌数较高的样品（不知稀释多少倍，因菌数必须稀释至80个左右），而且整个检测时间还不够快（通常需16h以上）。
②微热量法：利用细菌生长时产生热量的原理进行测定。由于各种微生物的代谢产物热效应不同，因此可显示出特异性的热效应曲线图。由于培养基含有多种成分，微生物则产生多种不同的代谢物，以此表现出的热效应为多个曲线峰。微量热技术是一项灵敏度高、测量准确的热分析技术，具有定量、实时、在线、动态描述等特点，如美国TA公司的TAMⅢ。
③放射测量法：利用细菌在代谢碳水化合物时产生CO2的原理，把微量的放射性标记引入葡萄糖或其他糖类分子中。细菌生长时，糖被利用并放出标记的CO2，将生成的放射性标记CO2从培养装置中导出或用化学法吸收后，利用专用的放射测量仪来测定放射性CO2，放射量与菌数成正比。
BACTEC MGIT 960 SYSTEM是集分枝杆菌（Mycobacterium spp.）快速生长培养、检测及药敏技术为一体的全自动分枝杆菌培养仪。该仪器容量为960孔，平均分布于三个相对独立的培养箱，每个培养箱可垂直放置320个内置荧光显示剂的MGIT分枝杆菌生长指标培养管。通过连续检测接种标本的培养管所显示的荧光强度的变化从而判断是否有分枝杆菌生长。若接种的MGIT培养管中有分枝杆菌生长，管中的营养成分和氧气将不断地被消耗，MGIT培养管中的荧光显示剂将随着管内氧气浓度的变化而发生反应。一旦培养管内氧气被利用，管内荧光指示剂将在特定光源的激活下释放荧光。BACTEC MGIT 960荧光强度记忆探测器将每隔60min连续测定培养管内的荧光强度，从而判断管内分枝杆菌的生长情况。
（2）传感器技术传感器的突出特点是可以实时地、在线地检测生物分子之间的相互作用。在微生物检测中应用的传感器主要有电化学传感器、光学传感器、气体传感器等。微生物的生长导致培养基的各种性质发生变化，如电导率、pH或CO2等。通过监控这些指标的变化，可以达到检测样品中微生物数量的目的。这些方法只要先用标准方法对比做出标准曲线，就可以达到快速定量检测菌数的目的。
①电化学传感器：微生物利用低电导率的大分子物质（如蛋白质、多肽及碳水化合物等）进行新陈代谢，生成低分子带电荷的分解物，使电导率发生变化，电信号经放大后显示并记录电导率的变化。电化学技术的一般线性范围是从102～107CFU/mL（g）。此技术最明显的优点是检测成本便宜，且可以2～12h内出结果。此类产品最为被广泛应用且认可的是奥地利Sy-lab公司的微生物自动快速检测系统BacTrac4300，检测灵敏度为0.2～1个/mL（g）样品，且没有假阴性结果。
对于难以测量电导变化的微生物，采用测间接电导率的方法，通过测量KOH吸收微生物代谢产生的CO2后电导率的变化反映微生物的生长情况。可检测常见的各种食品、化妆品和药品，检测的微生物项目多，检测速度快，大部分项目24h内出结果，样品含菌量越高，出结果越快，只需数小时即给出结果。基于视窗系统的智能化软件，与标准方法相比，符合率达到90%～97%，能满足实验室检测的需要。
②光学传感器：微生物生长产生的代谢产物可使预加的指示剂颜色发生变化，由光学检测器检测其颜色变化，记录达到突变点的时间，可以达到检测微生物数量的目的。可以在30～48h内高通量检测大量样品。美国Foss公司的Microfoss微生物自动检测仪是利用在特定培养基中培养样品，微生物生长使培养基pH发生变化，产生的CO2改变CO2传感器的颜色这一原理。梅里埃的BacT/Alert微生物检测仪和美国BioLumix公司的实时微生物快速荧光光电检测仪是使用光子探测器实时检测CO2导致的培养瓶底部颜色变为黄色的CO2传感器。利用的代谢产物有李斯特菌生长产生秦皮甲素酶、念珠菌属的葡萄糖胺酶、副溶血弧菌的β-半乳糖苷酶和所有微生物都产生的氧化酶等。Microfoss检测系统的原理是，微生物生长导致培养基pH发生变化，由光学检测器检测底部琼脂层的颜色变化，记录达到突变点的时间。该系统的优点是可以实现快速检测；缺点为需要购买原厂的预装培养基，应用范围受到限制，成本高昂。法国梅里埃的BacT/Alert微生物检测仪基于微生物呼吸作用产生CO2的原理，CO2积累越多，底部的CO2传感器变黄，由LED发射一束光至底部，探头检测反射光的强度，光强度与微生物数量有一定关系。美国NHD公司的手持式肠道细菌快速检测系统，是将含荧光的底物加入选择性培养基中，细菌的特异性酶水解底物后释放出荧光，通过荧光检测仪来确定样品中微生物的量。此检测方法将荧光底物、培养基组成和不同培养温度三位一体来保证检测指标的特异性，最低检测限为1CFU/100mL或1MPN/100mL，最快检测时间为15min。
（3）流式细胞技术 流式细胞技术是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数的、快速的定量分析和分选的技术。样品中的微生物被荧光标记后，采用流式细胞技术进行计数，可对样品中的微生物进行快速检验。
①BactoScan FC：丹麦FOSS公司的BactoScan FC牛乳中总菌数快速检测仪采用流式细胞技术，可快速进行牛乳细菌计数（50～150样品/h）。缺点是死活细胞一起检测，消耗成本较高，仪器比较难保养，灵敏度不够高。
②美国Chemunex公司微生物快速检测系统：美国Chemunex公司将流式细胞技术与活细胞荧光探针标记及激光扫描技术相结合，推出最新一代的速度更快的Bactiflow以及更高端的ScanRDI和D-count微生物快速检测仪。其最大的特点是只检测活细胞数（总活菌、酵母和霉菌数），速度极快，处理量大。Bactiflow适用于含菌量较高的食品、化妆品及水等样品，适合实验室或研究用、日处理量不大于40个样品的场合。D-count适用于含菌量较低的不可过滤的食品、化妆品等样品，适合实验室或生产现场使用、日处理量大于40个样品的场合。ScanRDI不仅能检测样品中的大肠杆菌和大肠菌群细菌，而且能检测贾第虫和隐孢子虫，特别适用于医药工业、饮用水尤其是直饮水中对可过滤样品进行有害肠道菌及原生动物进行快速检测，灵敏度为1～5000个细胞。该系统的缺点是仪器昂贵，运作成本高，与免疫法相似。
二、致病菌快速检测技术
对特定致病菌的快速检测方法，从原理上分为免疫学技术、分子生物学技术和显色培养基技术等。
1.免疫学检测技术
免疫学检测技术是通过抗原和抗体的特异性结合反应的原理，再辅以放大技术来鉴别微生物。该方法具有高灵敏度和速度快等优点，样品经增菌后可在数分钟内检出。应用此原理的方法有竞争法和双抗夹心法等，其中放大技术有酶法、荧光法和纳米颗粒技术等。
（1）免疫磁珠分离技术免疫磁珠是运用核-壳合成方法合成的含有四氧化三铁超顺磁性的材料——微磁珠，磁珠表面覆盖有稳定性好、能进行后期标记的物质，利用这些物质表面的功能基团如氨基、羧基、巯基等进行抗体的共价或者非共价偶联，制成带磁性的免疫抗体磁珠。微生物免疫磁珠可以选择性地从环境、临床和食品中富集浓缩相应的微生物病原体。此技术具有灵敏、快速等特点，已得到广泛认可，获得中国商检行业标准（SN）、国际标准化组织（ISO）、美国分析化学家协会（AOAC）、食品及药物管理局（FDA）、加拿大卫生保健局（CHPB）的认可。如美国Dynal公司的Dynabeads磁珠和英国Matrix公司的免疫磁珠，可以检测沙门菌、李斯特菌、单核细胞增生李斯特菌、葡萄球菌肠毒素、大肠埃希菌O157、弯曲菌、副结核分枝杆菌（Mycobacterium paratuberculosis）和军团菌（Legionella spp.）等。(www.daowen.com)
免疫磁珠分离技术可以从大量样品迅速富集微生物，经常作为前处理步骤为其他筛选技术提供高浓度的微生物样品，如聚合酶链式反应（PCR）、酶联免疫吸附实验（ELISA）、DNA探针、荧光显微镜观察法和显色培养基法等。微生物免疫磁珠分选技术的操作过程具有高度重复且简单的特点，只有加液、吸液和磁分离等步骤，所以其操作过程仪器化也是发展趋势。现在市场上受到广泛认可的该类仪器有美国Invitrogen公司的BeadRrtriever全自动免疫磁珠分选系统，只需按一个按钮，40min内即可得到预期的高浓度样品。
（2）荧光酶标免疫 应用免疫双抗夹心法，将已知抗体固定于载体上，加入待测抗原，抗原与固相抗体结合，然后加入酶标抗体，再与抗原结合。抗体上的酶与酶底物反应，释放出带荧光的产物，发出荧光，荧光强度与抗原量成正比，通过测量荧光强度进行定性或定量分析。如4-甲基伞形酮磷酸酯在磷酸酶的催化作用下，生成具有荧光性的物质——4-甲基伞形酮和磷酸盐。法国生物梅里埃公司的荧光酶标分析仪就是建立在此原理上，可实现对多种微生物的检测。绿色荧光蛋白是海洋无脊椎动物的一种蛋白质，当受到紫外或蓝光激发，该蛋白即可发射绿色荧光。当绿色荧光蛋白和抗体或蛋白质相结合，在紫外或蓝光下即可定位抗体或蛋白质。
（3）免疫胶体金技术 胶体金是指具有颜色的粒子直径在1～100nm的金溶胶，颜色随金溶胶粒子大小不同而变化。胶体金在可见光范围内具有单一光的吸收峰，吸收峰的位置随胶体金颗粒的变化而变化，胶体金颗粒越大，其吸收峰的波长也越大。
胶体金免疫层析法是将胶体金标记、免疫反应及色层分析法等方法结合为一体的固相标记免疫检测技术。由于其方便快速、特异性强、稳定性好、不需要特殊仪器和试剂、肉眼可判读结果等优点而得到广泛的应用。该法是以微孔膜如硝酸纤维素膜为固相载体，将已知的抗原或抗体固定在载体上，形成检测线（T线）或质控线（C线），当样品通过毛细管作用在微孔膜上移动，与标有抗体的胶体金反应形成复合物，然后至检测线时又发生抗原抗体反应，形成肉眼可见的红色线条（图9-4）。胶体金免疫层析法包括双抗夹心法和竞争法，其中竞争法常用于检测小分子抗原。如美国SDIX公司的微生物致病菌检测条，符合AOAC（美国分析化学家协会）、GB（中国国标）等相应标准。
图9-4 胶体金快速检测试纸条模板及组成
胶体金检测条的优缺点：胶体金检测方法属于免疫检测法，检测的是死菌和活菌；该检测一般需要增菌过夜；增菌后的检测非常简单，一般约10min能完成；无需专门的检测仪器；进口检测条的价格比较高，通常要30～90元。
2.分子生物学检测技术
分子生物学检测技术具有特异性强、灵敏度高等优点，可以高特异性地鉴别菌种内的差别，甚至菌株间的差别，但容易导致较高的假阳性率。该类检测技术都需要样品先增菌再检测，一般第2d出结果。分子检测技术有普通PCR技术、实时荧光定量技术、等温扩增技术、多重检测技术和活菌鉴定技术等。
（1）分子标识库 筛选的分子标识必须满足两个条件：在种/属/血清型内要保守、在种/属/血清型间要特异。分子标识库的建立需大量实验与分析工作，包括成百上千种标准菌株和实际环境菌株的搜集、分子测序、生物信息学分析、引物设计与验证等。目前微生物分子标识库可以分为三大类：种属水平基因、血清型基因和毒力基因。
①核糖体基因：包括细菌的16S rRNA、23S rRNA和5S rRNA，真菌的18S rRNA、28S rRNA和5.8S rRNA。rRNA在所有微生物中共有，在进化过程中保持了高度的保守性，所以可作为通用引物的特异性序列。但是，对于亲缘关系较近的种属，单一利用细菌的16S rRNA、23S rRNA或者真菌的18S rRNA，并不能完全区分这些菌种。内部转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）序列是指16～23S rRNA基因间区，其没有特定功能，进化速率比16S rDNA快10多倍，其特异性更强，对于亲缘关系较近的种属的区分比16S rRNA和23S rRNA更具优势。但ITS序列不能对所有菌株进行鉴别。
②毒力基因：特异性相对更加保守，编码细菌致病性蛋白质，位于病原菌染色体上特定区域——毒力岛（PAI）上。一般一个细菌含有多个毒力基因，如已发现的沙门菌毒力岛大约有十几个，即SPI1、SPI2、SPI3、SPI4、SPI5等。
③血清型基因：细菌表面多糖抗原在宿主免疫系统长期压力下，形成自然界中已知最突出的多样性，其对应的基因簇是细菌染色体上最具多样性的区域，所以基于表面多糖抗原基因簇的分子标识也是公认的特异性分子标识，如变形杆菌的特异性基因wzy，大肠杆菌的高特异性基因O-抗原基因簇中的寡糖单位处理基因和糖基转移酶。
肠道沙门菌（S.enteric）亚种Ⅰ具有约1500种血清型，基本都以温血动物为宿主，不同血清型间差异基因数目不足100个，主要集中在IS（insertion sequence）因子、原噬菌体序列（bacteriophage）等水平迁移基因。
（2）实时定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）向PCR体系中加入荧光基团，通过实时监测PCR检测体系中的荧光信号而达到实时监测目的PCR扩增片段数量的目的，从而推断出PCR体系中的初始目标片段数量的定量技术。可采用的荧光信号主要有两类：非特异性染料和特异性探针标记。非特异性染料常用的有SYBR GREENⅠ和SYBR GREENⅡ，特异性探针标记常用的有TaqMan探针、杂交探针和分子信标探针等。目前，商品化的荧光定量PCR技术检测微生物的试剂盒有杜邦全自动病原微生物快速检测系统。该检测技术不仅是定量检测微生物含量的常规且成熟的检测法，也是应用于研究的常规技术，并在此基础上也发展出其他新型技术，如纳米金实时PCR、前置放大技术等。
逆转录PCR是在反转录和定量PCR的基础之上发展起来的，在反转录酶的作用下以mRNA为模板合成cDNA第1条链，然后在DNA聚合酶作用下进行PCR扩增，扩增期间通过连续监测荧光信号的强弱测定特异性产物的含量，然后根据标准曲线计算mRNA的含量。
（3）等温扩增技术可以在恒定的温度下对特定核酸片段进行扩增的技术，包括链置换扩增、切口酶恒温核酸扩增、滚环扩增、依赖解旋酶恒温扩增、依赖核酸序列扩增、转录介导扩增、交叉引物扩增和环介导等温扩增等技术。目前，研究成熟并产品化的技术有环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP），如3M公司的分子检测系统，检测时间从普通PCR技术的1～3h减少到15～60min，灵敏度是普通PCR的100～1000倍，与其相配套的便携式仪器有浊度仪和荧光检测系统等。LAMP技术的缺陷是容易造成假阴性结果。后期出现很多去污染剂或其他设备的开发，如杭州优思达生物技术有限公司的恒温扩增核酸试纸条检测试剂盒，将分子扩增、杂交技术和胶体金技术结合，使整个检测过程处于封闭状态下，防止假阳性的结果。
LAMP技术在细菌、病毒、寄生虫、支原体检测中具有较大的潜在应用价值，商品化LAMP诊断试剂盒不断涌现。目前已经研制出了SARS病毒、肺结核杆菌、李斯特杆菌等LAMP检测试剂盒等。LAMP技术还被用于痢疾、艾滋病的检测。LAMP技术在病源检测、食源性卫生检测等方面愈发独树一帜，应用越来越广泛，发展潜力巨大。
LAMP的局限性：（a）较易出现气溶胶而呈假阳性；（b）引物设计要求较高，数量多于常规PCR且结构更复杂，故而难度较大；（c）扩增产物为茎环结构和花椰菜样结构的DNA混合物，使得测序、克隆和表达等后续试验开展难度较大；（d）在稳定性、重复性以及准确率等方面与常规PCR检测仍有一定距离。
（4）多重PCR检测技术在同一个PCR反应体系加入两对或多对引物，以扩增多个目标片段，达到同时检测多个目标对象或快速分型的目的。与普通PCR相比，多重PCR技术具有普通PCR的快速、操作简便等特点，同时节省了检测时间与成本，使检测效率大大提高。该检测技术需要克服的缺点是检测体系复杂导致的检测灵敏度下降和定量准确性等问题。目前也有针对这些问题的研究，如通用引物多重PCR技术，由于特异引物只在前面几轮PCR扩增需要，后面大部分PCR扩增只需单一的通用引物，所以大大降低了PCR扩增的复杂性，提高了多重扩增的灵敏度与准确性。此类技术产品有迪奥公司采用双重PCR-荧光探针法检测沙门菌（FAM通道）和志贺菌（JOE通道），可以同时快速定量检测两种致病微生物。
为寻找快速且准确的病原微生物检测方法，在普通多重PCR技术的基础上研究出一种新的通用引物多重PCR（universal primers，multiplex PCR，UP.M.PCR）技术。利用该技术对食品中主要的3种致病菌——大肠杆菌、单增李斯特菌和沙门菌进行同时检测。经过单重PCR验证、二重以及三重UPPCR反应条件和体系优化，表明该方法的最低检测限为0.5pg目标DNA，复合引物和通用引物的加入量分别为2nmol/L和300nmol/L。此方法检测灵敏度高、病原菌检测限低，可在实践中应用。
（5）活菌定量分子检测技术EMA-qPCR技术（DNA结合染料叠氮溴乙锭EMA与RT-PCR相结合）是以EMA选择渗透进入死细胞非正常的细胞膜内，与死细胞内的DNA发生共价不可逆的结合，从而抑制其PCR扩增，使得只有活菌DNA可以作为扩增模板进行PCR扩增，能有效降低传统PCR检测的假阳性，使检测结果更加准确、可靠，检测时间仅为1.5～3h。
（6）可视基因芯片与传统基因芯片不同，可视基因芯片能将特定的分子结合转变成可直接肉眼观察到的信号。该技术采用生物素（抗原）化标记的引物进行PCR扩增，扩增产物与芯片上的探针进行杂交，接着用辣根过氧化物酶抗体处理，此时结合了生物素标记的杂交DNA链就会在辣根过氧化物酶抗体和3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（3，3′，5，5′-tetramethylbenzidine，TMB）的作用下产生沉淀改变芯片的厚度，从而产生肉眼可辨的信号。该技术具有高通量、灵敏且快速的优点；也存在一些缺点，如芯片稳定性和检测范围等问题。可视基因芯片技术在食源性致病微生物检测、转基因食品检测和真假植物油鉴别、食物过敏原检测中具有较大的应用价值。
（7）AFLP技术AFLP是基于PCR技术扩增基因组DNA限制性片段的新的分子标记技术。AFLP反应程序主要包括模板DNA制备、酶切片段扩增及凝胶电泳分析3个基本步骤。首先制备高分子质量基因组DNA，然后选择6个碱基识别位点的限制性内切酶（通常是EcoRI或PstI或SacI）进行酶切，酶切后的限制性片段在T4连接酶的作用下与特定的接头相连接，形成带有接头的特异性片段；然后在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的选择性扩增；PCR产物变性后在含尿素的聚丙烯酰胺变性胶上电泳；最后进行多态性比较分析，特异性片段回收克隆分析。
在食品致病菌的快速检测方面，所有的血清型都具有独特的AFLP指纹图，而且具有较高的分辨率，这使得AFLP在进行细菌区分时能够快速地做出鉴定，十分适合对一些病原菌的快速检测。在食品有益菌的准确鉴定方面，菌株水平鉴定中，AFLP技术有着独有的优势。另外，高分辨率的AFLP也适合对酸乳中的各类乳酸菌进行准确的鉴定，对乳酸菌产品的质量进行好的控制。将AFLP技术运用在食品微生物的检测中是非常有效果的，有助于对食品安全的实时监控。
（8）变 性梯度凝胶电泳技术变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）利用具有化学变性剂（尿素和甲酰胺）浓度梯度的聚丙烯酰胺凝胶电泳将特异性PCR扩增产物区分开来，其分辨率高于琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳，检测的基因序列可以达到一个碱基的差异。首先对目标DNA进行特异性（如16S rRNA或18S rRNA）PCR扩增，得到不同长度和/或碱基组成的扩增产物。扩增产物在含有线性递增变性剂的聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，由于DNA序列碱基组成和排列的差异，使得双链DNA分子具有不同的解链温度（Tm），当某一个双链DNA分子泳动到DNA变性所需的浓度时开始解链，解链程度越大，所遇到的迁移阻力越大，DNA分子的电泳迁移率降低，产生的迁移阻力与电场力平衡时，该DNA分子即可停留在该变性剂浓度梯度的凝胶中，因而不同片段的DNA分子可以形成相互分开的条带图谱。
采用PCR-DGGE技术能揭示微生物群落结构的真实状态，为食品溯源提供依据，在水产品、酒类、发酵食品、肉制品等领域研究食品微生物多样性中得到广泛应用。PCR-DGGE技术从食品样品中提取微生物基因组DNA后，选择有效扩增的引物进行特异性PCR扩增，对扩增产物应用DGGE技术进行微生物群的结构分析，可以得到食品微生物多样性的信息，在食品微生物溯源中具有广泛的应用前景。
3.显色培养基技术
利用显色培养基鉴定微生物是以微生物的生化反应为基础，通过在培养基中加入细菌特异性酶的显色底物，直接根据菌落颜色对菌种做出鉴定。常见的食源性致病菌检测中，李斯特菌显色培养基、大肠杆菌显色培养基、沙门菌显色培养基、金黄色葡萄球菌显色培养基等已被广泛应用于食品、医药和环境监测等领域，极大提高了微生物检测的效率。但是，显色培养基也存在一些假阳（阴）性等问题，其设计尚待优化。
（1）大肠杆菌显色培养基96%～98%的大肠杆菌产生β-2-D-2-葡萄糖苷酸酶（β2D2Gud），绝大部分沙门菌、志贺菌和耶尔森菌不能产生Gud，因此利用Gud酶底物可以有效地检测大肠杆菌。目前开发的显色培养基常用酶底物有：5，2-溴-2，4，2-氯-2，3，2-吲哚-2-β-2-D-2-葡萄糖苷酸（X2 Gluc）、邻硝基酚-β-2-D-葡萄糖苷酸（PNPG），底物被Gud水解后产生显色物质使菌落呈现特殊的蓝色或黄色。法国科玛嘉CHROM agar E.coli是目前应用较广泛的大肠杆菌显色培养基，在这种培养基培养24h后，大肠杆菌呈现蓝色菌落。近年来，我国企业也开发出该类型的显色培养基产品。
（2）沙门菌显色培养基 德国Merck公司生产的显色培养基Rambach agar以丙烯乙二醇和5，2-溴-2，4，2-氯-2，3，2-吲哚-2-β-2-D-半乳糖吡喃糖苷酸（X2GAL）为底物检测沙门菌，沙门菌能水解乙二醇产酸，不能水解X2GAL，在培养基上产生特殊的红色菌落。临床检测结果表明其效果明显优于传统培养基，且假阳性率较低。
（3）金黄色葡萄球菌显色培养基DNA酶和凝固酶是金黄色葡萄球菌重要的标志酶。以甲苯胺蓝、甲基绿、吖啶橙和5，2-溴-2，4，2-氯-2，3，2-吲哚-2-胸苷-2，3，2-磷酸等为显色底物（如CHROM agar Staphylococcus aureus）或以D2phe2pro2arg2β奈胺为底物，都能有效检测鉴定金黄色葡萄球菌。法国CHROM agar公司和瑞士Fluck公司都已研制出检测该菌的显色培养基，并广泛应用于食品卫生行业。
（4）李斯特菌显色培养基 李斯特菌是一类个体较小的革兰阳性杆菌，包括7个种，其中只有单增李斯特菌和绵羊李斯特菌（L.1 ivnovii）具有致病性。绵羊李斯特菌是动物致病菌，被列为20世纪90年代四大致病菌之一，是食品卫生行业的常检致病微生物。近年来，许多国家致力于李斯特菌显色培养基的研究，针对李斯特菌特有的肌醇磷酸磷脂酶（PI2PLC）和β2D2葡萄糖苷酶（β2D2glucosidase）设计显色底物对李斯特菌进行快速检测。
（5）其他显色培养基 开发的其他病原细菌快速检测显色培养基还有大肠杆菌O157∶H7显色培养基、阪崎肠杆菌显色培养基、弧菌显色培养基等。
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