真菌分布广泛，几乎占据地球上所有的生态节点。真菌能够形成不同形态的有性和无性生殖结构。有些真菌在其生活史中存在有性和无性两个阶段，有些真菌在人工培养条件下只能观察到一个生活阶段（有性或无性阶段），很多真菌如一些植物内生真菌甚至不能产生任何生殖细胞（有性和无性孢子）。此外，很多真菌与高等动植物发生紧密的共生或寄生关系（如白粉菌、锈菌、动物致病菌和菌根真菌等），并与宿主共同进化（协同进化，coevolution）。真菌的多样遗传系统、生活史类型和与其他生物的互作关系，决定了不同真菌具有不同的进化速度和模式。真菌的这些特点，给其分类与鉴定带来了困难。采用不同的分类学特征，真菌也存在着生物学种、生态种、表型种、系统发育种等概念。按照国际真菌分类委员会（International Commission on the Taxonomy of Fungi，ICTF）或国际植物命名法典（International Code of Botanical Nomenclature，ICBN）当前种的概念，一般基于表型特征、生态节点、形态学、生理学、分子标记等特征对真菌进行分类和鉴定，在一些属，还会采用分泌物谱等特征。也就是说，真菌的分类与鉴定也是采用多相分类鉴定技术，使产生的分类系统和鉴定结果更加接近于真菌的自然属性。

一、形态学和生殖结构特征

真菌的形态学特征比较直观，容易观察和记录。形态学特征是传统真菌分类鉴定的主要特征。对无性繁殖真菌，很多形态学特征直接用于分类和鉴定，如菌落特征（质地、边缘、形态、色素、味道等）、无性孢子和产孢结构（颜色、性状、大小、表面纹饰等）、无性孢子类型（游动孢子、分生孢子、孢囊孢子、芽孢子、厚垣孢子等）、产孢方式（体生式、芽生式）等。对有性繁殖的真菌，有性孢子类型（卵孢子、接合孢子、子囊孢子、担孢子）、形态等是重要的分类特征，一些微观特征会影响真菌分类。例如，基于子囊孢子的萌发孔和子囊表面结构，可将Corynascus verrucosus和Corynascus sepedonium分开。在担子菌，子实体的形态和大小、担孢子的颜色和微观形态、对梅氏试剂的反应、菌褶的细微形态和结构差异、菌柄和菌盖的菌丝体结构等，是物种鉴定的重要特征。显微技术的进步，如光学显微术的改进（如相差显微镜、微分干涉显微镜等）及超薄切片技术、扫描电子显微镜、透射电子显微镜、差别染色技术等的应用，有助于真菌形态学鉴定。

然而，单纯依靠形态学特征，难以对一些真菌进行准确鉴定。相对于生殖隔离和遗传隔离，形态学趋异发生的时间更晚，仅依靠形态学特征确定真菌的系统发育关系难度更大。相对于高等动植物，真菌可用于分类鉴定的形态学特征相对较少。而且，真菌的形态学特征受培养条件（营养条件和环境条件）的影响较大，难以标准化，描述上存在着一定的主观性。依靠形态学特征分类鉴定难度更大。很多真菌在人工培养条件下难以诱导有性生殖甚至无性生殖，特别是对于仅发现无性生殖，甚至在人工培养条件下不产孢子的真菌（称为形态分类单元morphotaxa或形态型morphotype），依靠形态学特征和生殖特征难以准确反映不同真菌分离物的系统发育关系。例如，很多真菌与其无性型被鉴定为2个不同的种，出现2个学名。

理论上讲，两个或多个有亲缘关系的生物种，可能有明显的形态差异，它们可以从形态上清楚区分。但是，也可能它们之间没有任何可资区别的形态特征或只有细微的形态差异，这就是隐形种复合群（cryptic species complex）。在真菌中，隐形种复合群或隐形种十分常见。这些隐形种间没有太近的亲缘关系（故不构成同一复合群），使得以形态特征为基础的分类研究常出现误判。在真菌物种形成进程中，生态、空间及时间等隔离与生殖隔离有异曲同工之效。也就是说，在自然界中，一些真菌通过交配型基因（mating-type genes）限制种间基因交流，但也有许多真菌可能不是通过内在的生殖隔离而是借助外在的生态、时空等隔离来阻止种间基因交流。生态多样性是物种形成的基础，生态适应选择是物种形成的动力。一些亲缘关系较远的真菌长期生活在相同的生态环境，进化出类似的形态学特征（趋同进化，convergent evolution），如担子菌的腹菌化（gasteromycetation）和子囊菌的块菌化（truffle syndrome），真菌在适应特殊气候（如干旱）和传媒（如啮齿类动物）等因子的演化中，大量没有亲缘关系的类群出现了相似的结构（杨祝良，2013）。然而，与其进化关系较为密切的大量真菌分离物，由于生活环境不同，可能形态学特征表现出明显的差异（趋异进化，divergent evolution）。这在物种进化中具有十分重要的意义；但对分类工作者来说，却带来了预想不到的困难。形态上的趋同演化，使得以形态特征为基础的分类研究常出现误判。因此，有必要从遗传本质即分子遗传学的角度去探索，以便为确立可靠的亲缘关系提供充分的证据。

二、生态适应性和生理特征

生态节点是真菌物种形成和物种描述的重要因素，常用于植物病原真菌和蕈菌分类鉴定。生态节点数据有助于描述属内不同种的菌株群。在真菌进化过程中，随着时间的改变，真菌改变其生态节点，并适应其新的栖息环境。一些通常认为非致病、可利用纤维素基质的真菌，随着生态节点的改变，可变成致病真菌。例如，有报道哈茨木霉（Trichoderma harzianum）的一个菌株能引起免疫缺陷病人的感染（其他菌株可用作作物栽培的生物肥料菌剂）。适应新节点、不同的温度、pH等在物种形成中发挥着重要的作用。因此，生理学特征对物种描述也是必要因素。例如，在毛壳菌属（Chaetomium）研究中，使用生长忍受的最低和最高温度来归类不同的真菌菌株。类似的因素也用于青霉、曲霉、镰刀菌等真菌的表征。在青霉和曲霉分类中，肌酸-蔗糖-琼脂培养基用作筛选产酸性能的半选择性培养基。

三、次级代谢产物和其他生化标记

化学分类在细菌、放线菌和酵母菌分类鉴定中应用较多。在真菌，化学分类仅限于脂肪酸、蛋白质和碳水化合物等少数指标。在真菌分类鉴定中，次级代谢产物使用得不广泛，因为真菌产生次级代谢产物具有不稳定性和不一致性，而且次级代谢产物的种类较多。产生次级代谢产物可视作真菌分类鉴定的额外特征，而不是必需特征。基于次级代谢产物的真菌化学分类已经成功用于很多大型子囊菌属，如链格孢属（Alternaria）、曲霉属、镰刀菌属、炭团菌属（Hypoxylon）、青霉属、穗霉菌属（Stachybotrys）和炭角菌属（Xylaria）等，以及少数担子菌属的分类鉴定，但在接合菌门（Zygomycota）和壶菌门（Chytridiomycota）的分类鉴定中没有采用。在炭角菌科（Xylariaceae）真菌分类鉴定中，次级代谢产物是重要的性状。在炭角菌科，除了形态学特征，子座产生的色素是轮层炭壳属（Daldinia）和炭团菌属定种的重要标准。这些色素的产生稳定，方便检测。在轮层炭壳属多相分类中，研究了几个种的次级代谢产物产生谱，是定种的重要性状。其他生化标记，如埃利希反应（Ehrlich reaction）用于青霉Penicillium subgenus Penicillium亚属、曲霉Aspergillus section fumigati和Aspergillus section nigri组的分类鉴定。ICBN推荐分泌物谱用作曲霉属的种类描述。(www.daowen.com)

四、分子标记和系统发育分析

真菌核苷酸取代的速度（每年每个核苷酸位置有10 ^-9～10 ^-8取代）类似于细菌和大型真核生物。因此，真菌核糖体RNA基因和一些蛋白编码基因的序列分析，近些年来广泛用于真菌分类鉴定，使真菌分类学发展到真菌系统学。核酸序列分析是目前真菌分类和命名研究的热点方法和基本手段。通过核酸序列构建真菌系统发育树，进行系统发育分析，可以快速检测到真菌演化过程中所出现的代表各种分类等级的大量单一支系（monophyletic clades），为建立各分类等级的新分类单元提供有力证据。较之DNA杂交和RFLP等分析的结果，核酸序列更加准确稳定，具有广泛的可比性；由于特定基因以“分子钟”机制恒速变异，其序列差异程度能直接反映物种之间的亲缘关系。

在真菌中，一个物种内在的遗传多样性是形态表征或生理生化多样性难于体现的。相反，分子标记对于认识物种的遗传多样性和演化具有较高的解析度。真菌分类工作者的一个主要任务就是研究物种划分及物种间的亲缘关系。但是，由于物种在地球上的演化历史往往久远而复杂，趋同演化、平行进化（parallel evolution，由共同祖先分出来的后代以同样趋势进化的现象）、逆向进化（再获得祖先状态）、种间杂交、不完全谱系分选（incomplete lineage sorting，是指由于物种分化时间极短，使得祖先基因的多态性在分化的物种里随机地固定下来）、基因重组（gene recombination）并存，人们很难把握哪些性状是共有衍征（synapomorphy，从其最近共同祖先承袭而来的两个或多个支系共有的衍生性状状态），哪些性状为同塑性状（homoplasy，是指没有共同祖先而趋同演化的性状），仅凭形态解剖特征、超微结构及生理生化指标，不易准确界定系统发育中的单系支系（monophyletic clade）。利用分子生物学数据特别是DNA核苷酸序列，结合生物信息学分析方法，可以快速发现大量单系支系，为建立各分类等级的新分类单元提供有力证据。

核酸序列分析需选用合适的靶序列，其必须存在于所有分类单元，并以适当的速率演化；同时，还可检测其碱基组成和密码子偏离。核糖体RNA和一部分持家基因序列广泛存在于所有生物细胞中，其转译产物具有至关重要的生理功能，并以稳定的速率进化。真菌的rRNA为核糖体组成的关键成分，其转录前rDNA在系统发育研究中发挥了重要的作用。真菌rDNA包括5S、5.8S、18S和28S rRNA基因。它们在染色体上头尾相连，串联排列，相互之间由间隔区（internal transcribed spacers，ITS）分隔。rDNA存在广泛，多拷贝，在长期进化中形成了高度的保守性和一定的变异性，可用于不同分类水平的系统学研究。ITS序列不加入成熟核糖体，受到较小的选择压力，进化速率很快，表现出极为广泛的序列多态性，其在种内极为保守和一致，种间差异比较明显。因此ITS序列（包括ITS1、ITS2和5.8S rRNA）常用于属内种间和亚种间的分类鉴别。此外，一些相似不同源的蛋白编码基因也被用于真菌的分子系统学分类，如线粒体细胞色素C氧化酶亚基I（COI）基因、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（gpd）、β-微管蛋白基因（β-tub）、RNA聚合酶II基因（rpb1和rpb2）、钙调蛋白基因（cal）、γ-肌动蛋白基因（act）、ATP合成酶基因（atp6）、翻译延长因子1α基因（EF-1α）等（表8-2）。然而，由于不同物种之间DNA进化速率不同，会出现基因树冲突；在单个担子果和子囊果，甚至纯培养物内部存在基因组内部变异，如存在平行同源或非直系同源基因拷贝，会导致过高估计种的数量。因此，仅仅使用长度有限的单基因片段不能准确地对真菌分类。采用多基因位点序列分析，即采用多基因系谱一致性系统发育种识别法（GCPSR），是真菌鉴定和真菌多样性研究的行之有效的方法。

表8-2 真菌鉴定常用的靶位基因

rDNA的ITS是真菌鉴定首选的测定分析序列。ITS序列用于真菌分类鉴定的主要优势在于其大小合适（约500bp），引物通用性强，扩增成功率高，便于高通量测序与分析，而且在GenBank等数据库中存有最多的DNA片段序列，同时在CBOL的生命条形码数据库（the barcode of life data systems，BOLD）中收集有凭证标本（菌种）标识的真菌ITS等序列。ITS序列被广泛应用于真菌的物种鉴定和低分类等级的系统演化关系分析。在子囊菌中，建立了肉座菌属Hypocrea与无性型木霉属（Trichoderma）物种的DNA条形码快速鉴定体系（The TrichOKEY v 1.0），并成功地将分自土壤的51个木霉属菌株鉴定到已知菌种，而且发现有2株菌可能是新种。在地衣型子囊菌中，通过对28个科、55个属、107个种的351份地衣标本的ITS序列分析表明，92.1%的物种存在DNA条形码间隔区（barcoding gap），96.3%的标本可以鉴定到种。在担子菌中，ITS可有效区分欧洲的丝膜菌（Cortinarius ser.Callochroi）组的79个种和鹅膏属（Amanita）的36个种；在植物病原锈菌中，ITS可将 Chrysomyxa属（10种）的90%和Melampsora属（5种）的80%种类区分开。在接合菌中，除近缘种外，ITS可以将毛霉目Mucorales其他种类区分开。在无性型真菌（anamorphic fungi），ITS序列分析成功地应用于水生丝孢菌（aquatic hyphomycete）的鉴定中。建立了外生菌根真菌的分子鉴定数据库UNITE（http://unite.ut.ee/index.php），该数据库只收集经过分类专家可靠形态鉴定子实体标本的ITS序列，建立了有实物标本标识的ITS序列数据库。目前，UNITE网已收录了约150属、1079种的2764条ITS序列。ITS作为外生菌根真菌鉴定序列，通过传统和高通量的DNA测序技术，广泛应用于森林生态系统中外生菌根真菌物种多样性的检测与鉴定中。目前主要利用ITS序列进行不产孢内生真菌的鉴定，并且经过真菌ITS序列种间变异率分析，大家普遍接受种间序列阈值为97%的相似性。

目前在分子鉴定和系统学分析中常用的DNA数据库有GenBank、EMBL、DDBJ和UNITE等，其中ITS序列数量最大，如在GenBank中大约有7万多条ITS序列，但是至少20%的ITS序列没有凭证菌种或标本的注释，甚至有的序列来源于错误的物种鉴定。因此，在真菌鉴定时，选择基因库中与待鉴定菌株相关的ITS序列建立系统发育树时，要选择来自分类学家的可靠鉴定的标本或菌种的ITS序列，如CBOL建立的生命条形码数据库重点序列，以保证分子鉴定的可靠性。在ITS序列分析中，通常采用标准的分子系统学方法建立多种系统树，如邻接法（neighbor-joining，NJ）、聚类法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）、最大似然法（maximum likelihood，ML）、最大简约法（maximum parsimony，MP）和贝叶斯法（Bayes）。由于不同分析方法的运算时间差别很大，而且适用的条件不同，因此在使用时应根据需要进行选择，在不影响结果的前提下应选择最简单的方法。目前最常用的是NJ法，通过MEGA或PAUP计算种内和种间的遗传距离，根据距离计算结果建立聚类树。种间距离通常采用pairwise uncorrected p-distance或Kimura-2-parameter distance（K2P）。K2P是距离值很小时的最佳模型，也是CBOL推荐使用的距离计算模型。种内遗传距离通常采用3种参数表示，即K2P距离、平均θ值和平均溯祖度（average coalescent depth），其中平均 θ值是指每个物种内不同个体间的平均K2P距离，目的是消除不同物种因采样个体数不均引起的偏差；平均溯祖度是指物种内所有个体间最大的K2P距离，用以反映种内最大变异范围。另外，在数据较多的时候，还可以进行多元尺度分析，以图的形式更直观地反映物种水平的分辨效果。