酵母菌的鉴定以山东农业大学博士生陈汝鉴定的子囊菌酵母新种Kazachstaniataianensis sp.nov.为例进行说明。根据酵母分类学标准方法，进行了一系列形态学及生理和生化特征测定。采用Makimura等报道的方法提取酵母菌DNA。采用Bai等描述的方法扩增ITS-5.8S rDNA、26 rDNA D1/D2区序列，采用Wang等报道的方法扩增18S rDNA序列。采用Clustal X软件对序列进行比对，先用Kimura的二因子参数模型构建距离矩阵，再根据距离矩阵产生了N-J系统进化树，自展检验重复1000次。相应的参照序列从GenBank中下载，在进化树上以GenBank登录号的形式表现。

一、实验方法

1.酵母菌的分离

称取1.0g基物，分别置于10mL YEPD（酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，添加200g/mL氯霉素）液体培养基中摇匀，25℃培养2～3d后稀释涂布YPD平板（内含200g/mL氯霉素），25℃培养2～3d。根据菌落形态特点挑取大小、形态不同的菌落转接斜面。根据Yarrow（1998）的方法对菌落质地、颜色、边缘和表面特征等进行形态学的初步归类。纯化后的酵母菌置于20%甘油管中-80℃冰箱中保存。

2.酵母菌的鉴定

（1）常规鉴定参照Yarrow（1998）在《酵母菌的分类学研究》（The Yeasts，a Taxonomic Study）第4版中所描述的标准方法进行。

①形态观察

a.常用培养基

（a）YM液体培养基：酵母浸提物3g，麦芽浸提物3g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，蒸馏水1L，pH5～6，121℃灭菌15min。

（b）YM固体培养基：在1L YM液体培养基的基础上添加20g琼脂，121℃灭菌15min。

（c）麦芽汁固体培养基：10Brix麦芽汁1L，20g琼脂，121℃灭菌15min。

b.液体培养特征：首先把菌种划线接种于新鲜麦芽汁斜面上，17～20℃活化培养3～4d。挑取一环活化好的菌体接种到装有40mL YM液体培养基的100mL三角瓶中，17～20℃静置培养5～7d，观察并记录培养特征。细胞形态特征：球形、亚球形、椭圆形、卵圆形、柱状、棒状、新月形、三角形或其他形状；繁殖方式：是否产生掷孢子及掷孢子的形态和大小，是否芽殖及芽细胞产生的方式（多边芽殖、两极芽殖、单极芽殖），是否裂殖或产生梗孢子及菌丝断裂的方式；细胞大小：测量细胞个数不少于20个；宏观特征：17～20℃培养一周后，观察底部有无沉淀及其质地，是否形成环、菌璞，17～20℃继续培养4周后再次观察并记录。

c.固体培养特征：将活化好的菌种接种于新鲜YM斜面，20℃培养30d后观察并记录。菌落质地：干酪状、黏液状、松脆状或坚韧状；菌落颜色：乳白色或奶油色、黄色、橙色、红色、棕色；菌落表面特征：反光或暗淡、光滑或粗糙、是否有条纹、是否有疣状、脊状突起以及是否产生毛发样突起等；菌落边缘：是否光滑（全缘）、波浪状、裂叶状、蚀刻状、根状等。

②假菌丝的形成（Dalmau平板法）：将活化好的菌株接种在玉米粉琼脂培养基平板上（平板接种前预先放几天使表面干燥），在平板的一边划直线接种，在中间盖上一片无菌盖玻片，相对的另一边点接两点，其中一点上放置无菌盖玻片。接种好的平板在20℃培养7～30d后观察假菌丝的有无。

③有性阶段的观察：将活化好的菌种接种在玉米粉琼脂培养基上，20℃下培养。接种配对菌种在平板上交叉划线，每隔两周在显微镜下观察一次是否发生配合菌丝和锁状联合及冬孢子。

（2）生理生化特征测试

①糖类化合物的发酵——杜氏管（Durham tube）法：把葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麦芽糖、山梨糖用蒸馏水配成200g/L的母液，棉子糖用蒸馏水配成400g/L的母液，过滤除菌后放入4℃冰箱内备用。用蒸馏水配制5g/L的酵母浸出粉溶液，每次取3.6mL分装到12mm的试管，放入倒置的杜氏发酵管，棉塞封口后121℃灭菌30min，然后每管内加入0.4mL糖母液，备用。将活化好的菌种制成菌悬液，取100μL接种于准备好的发酵试管内，摇匀，17℃下培养28d，期间观察杜氏管内气体产生与否及其产生量，第一周内每天记录一次，第二周内每2～3d记录一次，结果根据下列原则进行表述：“+”表示强发酵，7d内气体充满倒置管；“L”为延滞发酵，7d后倒置管迅速充满气体；“W”为弱发酵，倒置管内有气体，但直到最后也未充满；“S”为慢或延迟发酵，7d以后倒置管内才缓慢充满气体；“-”表示不发酵，倒置管内无气体积存；“V”表示同一种内有的菌株发酵，有的菌株不发酵。

②碳源化合物的同化——液体法：把各种碳源配成10倍浓度的母液，具体方法为：称取6.7g酵母氮基础培养基，加入与5g葡萄糖相当的碳源化合物（即与5g葡萄糖含有等量的碳），棉籽糖的浓度加倍，溶化后（若为有机酸先把酸度调至pH5.7）过滤除菌，然后放入4℃冰箱备用。

选用35种碳源化合物作为同化试验对象。六碳糖：D-葡萄糖、D-半乳糖、L-山梨糖；多糖：菊糖、可溶性淀粉；双糖：纤维二糖、乳糖、麦芽糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖；醇类：赤鲜糖醇、半乳糖醇、D-山梨醇、甘油、肌醇、D-甘露醇、核醇、甲醇、乙醇；三糖：松三糖、棉籽糖；五碳糖：D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-木糖；糖苷：α-甲基-葡萄糖苷、杨梅苷；有机酸：柠檬酸、DL-乳酸、琥珀酸、D-葡糖醛酸；其他还有D-葡萄糖胺和十六烷。

在试管中每管加入3.6mL蒸馏水，121℃灭菌30min后，加入0.4mL同化碳源母液制成同化管备用。糖液的最终浓度为0.5%。把活化好的菌种用无菌水制成菌悬液，调整菌浓度使悬液至半透光，用移液器吸取50μL至准备好的同化管内，17℃静置培养4周。每周分别记录结果。

同化结果的观察与记录方法：取一张白色卡片，用墨汁或黑色墨水划上3/4mm宽的直线。把培养1～4周的同化管充分摇匀，贴近卡片，透过培养液察看卡片上的黑线，并根据下述原则记录：“+++”为透过试管完全看不见黑线；“++”为可见黑线但呈一发散的模糊线条；“+”为黑线可见但边缘模糊；“-”为黑线清晰可见且边缘不模糊。同化结果按以下原则记录。强同化：一周为“+”，两周为“++”或“+++”；L（延滞同化）：一周不同化，两周后迅速变为“++”或“+++”；S（缓慢同化）：一周弱同化，两周后缓慢变为“++”或“+++”；W（弱同化）：头一周有同化，两周后记录为“+”；LW（延滞弱同化）：头一周不同化，两周后变为“+”；“-”为不同化；“V”为有些菌株同化反应为正，有些菌株同化反应为负。

③氮源化合物的同化：酵母菌可以利用很多含氮化合物作为氮源，包括硝酸盐、亚硝酸盐、盐酸乙胺、二盐酸乙胺和L-赖氨酸等。由于有些氮源化合物被酵母菌同化分解后的中间产物对酵母自身的生长有抑制作用，因而在液体法测试中常出现假阴性反应，故氮源的同化反应常用固体生长谱法测试。方法如下。

a.测试酵母菌饥饿培养：把活化好的菌株接种在4mL无菌碳基础培养基上，17～20℃培养5～7d，以消耗细胞内多余的氮源，防止出现假阳性结果。

b.接种：取11.7g酵母碳基础培养基和20g纯化琼脂粉，加1000mL蒸馏水，加热将琼脂粉溶化，108℃灭菌30min，冷却至大约45℃时倒入预先加入1mL饥饿培养后的酵母细胞悬液的平皿中，混匀后静置，凝固后放在17～20℃培养箱内数小时使平板表面干燥，然后将少量所测氮源化合物点在平板上。若是亚硝酸钠或乙胺，则用接种针蘸取二者的溶解液，点在平板表面上，以避免浓度过量而抑制酵母细胞生长。通常将一个培养皿用两条交互垂直的直线分为四部分，一部分点入硫酸铵作为阳性对照，一部分留作空白作为阴性对照，另外两部分点入所测试剂。

c.结果观察：置入试剂后的平皿在17～20℃下培养2～3d后观察并记录结果。阳性反应者在所点试剂处或周围有酵母菌落生长。

④熊果苷的裂解：熊果苷是一种糖苷，又称对苯二酚葡萄糖苷，用来确证酵母菌的β-葡糖苷酶的活性。该实验的原理是，若一株酵母菌能裂解熊果苷，则裂解产物羟基醌能与培养基内的三价铁离子反应产生褐色化合物。试验方法：先配制熊果苷琼脂（熊果苷0.5%，酵母粉0.5%，琼脂2%，121℃灭菌30min），灭菌后立即加入无菌1%柠檬酸铁铵（每10mL培养基3～5滴），然后倒平板备用。把活化好的菌种划线接入熊果苷琼脂平板上，17℃培养，若2～5d内培养基中有深褐色色素出现，则结果为阳性。

⑤在无维生素培养基中的生长状况测试：先制备10倍的无维生素培养基母液（取16.7g无维生素酵母基础培养基溶于100mL蒸馏水中，过滤除菌，放入4℃冰箱备用。在试管中加入3.6mL蒸馏水，121℃灭菌30min后加入0.4mL 10倍无维生素母液）。接种方法、培养条件及结果的记录与碳源同化试验相同。

⑥胞外类淀粉化合物的产生测试（淀粉试验）：选取碳源同化试验中培养4周后在含糖类或多元醇类化合物的同化管中呈阳性反应的试管，每管滴入1～2滴Lugol碘液（1.0g碘、2.0g碘化钾溶于300mL蒸馏水中），摇匀，呈蓝、紫或绿色者为阳性，表明有类淀粉类物质产生，否则为阴性。

⑦尿素酶试验

a.固体法：将测试菌株活化后接种于尿素琼脂上，17℃培养5d，每天观察一次，出现深粉红色者为阳性反应。尿素琼脂的制备方法：取1g蛋白胨、1g葡萄糖、5g氯化钠、2g磷酸二氢钾和0.012g酚红，溶于1L蒸馏水中，调pH为6.8，加入20g琼脂，加热熔化后分装试管，每只试管中分装4.5mL，108℃灭菌30min后，每只试管中加入0.5mL过滤除菌的20%尿素，混匀，做成斜面备用。

b.液体法：将测试菌株活化后，取一环接种于无菌水稀释过的尿素液体培养基中，17℃培养1～2d，每小时观察一次，出现深粉红色者为阳性。

⑧DBB颜色反应

a.液体法：菌种接种于5mL含0.5%葡萄糖的氮基础培养基中，17℃ 100r/min振荡培养3d，4000r/min离心5min收集菌体。菌体悬浮于0.5mL 0.05mol/L KOH中，放入沸水中加热10min。冷却至室温后，加入2.5mL 95%乙醇，充分混匀，2000r/min离心2min，弃上清，加入0.3mL新配制的DBB反应液，几秒钟后呈现紫红色者为阳性。

b.固体法：将菌种接种到碳基础-尿素琼脂上，17℃培养3d，再55℃培养过夜，然后冷却到室温，加入1～2滴新配制的冷的DBB反应液，室温放置1～2min，出现深红色或紫红色为阳性。(www.daowen.com)

碳基础-尿素培养基的制备：将11.7g碳基础培养基、0.2g Fuchsin酸、20g琼脂溶于900mL无菌水中，108℃灭菌15min，将100mL过滤除菌的20%尿素加到溶解的培养基中，混匀，做斜面或倒平板备用。

DBB反应液的制备：将15mg DBB盐（O-dianisidine tetrazotized，Practical Grade，Sigma）溶于15mL冰浴过的0.25mol/L Tris-HCl（pH7.0）缓冲液中，放在冰浴中30min内使用。

⑨高渗透压生长试验：将活化好的菌株接种到50%葡萄糖琼脂斜面上，17～20℃培养7～14d，每周观察一次。50%葡萄糖琼脂斜面的制备：在1%的酵母浸出粉中先溶解13g琼脂，再加入500g葡萄糖，定容到1000mL，分装到试管中，108℃灭菌30min，做成斜面备用。

⑩最高生长温度试验：将活化好的菌株接种到YM斜面上，分别在17～40℃的温度下培养5d，观察各个温度下菌体的生长状况，将生长最缓慢的温度定为最高生长温度。

（3）基于分子技术的鉴定方法

①26S rDNA D1/D2和ITS序列分析

a.总DNA提取：DNA的提取按照Makimura等的方法进行。用接种环从所测菌株的麦芽汁斜面上挑取一环菌体置于一已灭菌的1.5mL离心管内，加入100μL裂解液（100mmol/L Tris，30mmol/L EDTA，0.5% SDS，pH8.0，121℃灭菌30min），100℃水浴15min，加入100μL 2.5mol/L的乙酸钾，冰上放置30min。4℃下12000r/min离心5min，上清液转移至新的1.5mL离心管内，加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1，体积比），剧烈振荡后，12000r/min离心15min。将上清液转移至另一灭菌的1.5mL离心管内。重复上一步骤，将上清液转移至另一灭菌的0.5mL离心管内，加入等体积冷的异丙醇，-20℃静置15min，12000r/min离心15min。用100μL 70%的乙醇洗沉淀，将沉淀自然晾干。加入50μL已灭菌的双蒸水溶解DNA，置于-20℃冷藏备用。

b.PCR扩增：扩增26S rDNA D1/D2区的引物为NL15′-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3′和NL45′-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3′；扩展ITS区的引物为ITS15′-GTC GTA ACA AGG TTT CCG TAG GTG-3′和ITS45′-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3′。

c.PCR反应产物的琼脂糖电泳检测：取2μL PCR扩增原液，点样于1%的琼脂糖凝胶，电泳后采用溴化已锭染色，在紫外灯照射下初步确定是否扩出所要片段。

d.PCR扩增产物的纯化与测序：纯化回收后得到纯DNA样品，电泳再次检测后送交测序公司。有时候也可以直接送样品到测序公司，产物的纯化过程由公司做。

e.序列分析及进化树的构建：所得序列在国际核酸数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）中进行同源序列的搜索，可以得到该酵母菌株在这段序列上与其他亲缘关系相近的已知酵母菌的相关信息。用Clustal-X软件对多个序列进行匹配分析，用Neighbour-Joining方法对酵母菌株间的亲缘关系进行分析得到系统树，并根据Kimura的双参数模型计算其进化距离，Bootstrap值的计算分析根据1000次随机抽样进行。从系统树上可直观地看出测试菌株与近缘菌株的关系。

②SSCP分析方法：用Bio-Rad公司DCode^TM突变检测电泳仪进行SSCP检测。

a.20cm×20cm×0.75mm非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备：配制40mL 10%的凝胶。加入40%丙烯酰胺/亚甲基双丙烯酰胺（37.5∶1母液，体积比）10mL，10×TBE（89mmol/L Tris base，89mmol/L硼酸，20mmol/L Tris-EDTA缓冲液pH8.0）缓冲液4mL，100%甘油2mL，TEMED 40μL，10%过硫酸铵400μL，蒸馏水23.56mL。配好的凝胶混匀后立即加入到模具中，1h后拔出梳子，用1×TBE电泳缓冲液清洗点样孔3次。

b.单链样品的制备：把PCR产物稀释至1/5～1/2，含DNA 150～300ng，取5μL与等量的点样染料（0.05%溴酚蓝，0.05%二甲苯青，95%甲酰胺，4% 0.5mol/L EDTA，pH8.0）混匀，95℃下变性10min，迅速置于冰上放置15min。

c.点样与电泳：电泳缓冲液为1×TBE，电泳温度为8℃。电泳缓冲液要预先冷却或加热到8℃，把变性后的样品依次加入到点样孔中，200V电泳10～12h。

d.染胶与拍照：采用银染法。步骤如下。将电泳后的凝胶仔细从玻璃板上剥离，每块胶在300mL 10%乙醇中固定5min；倒掉乙醇，加入300mL 0.5%冰乙酸固定5min；倒掉冰乙酸，加入300mL 0.1%的硝酸银（硝酸银配成10倍母液，储存在棕色瓶中），在转速为100r/min的振荡器上放置15min；倒掉硝酸银溶液，用300mL蒸馏水漂洗一次；倒掉蒸馏水，加入300mL 1.5%氢氧化钠和450μL甲醛进行显色，2～5min后出现棕色带型；显色适度后，立即倒掉以上溶液，用蒸馏水洗两次，加入300mL 0.75%碳酸钠，放置15min；最后，用数码相机照相保存。

（4）数据处理用Microsoft Excel 2003和DPS软件进行数据分析，用DPS软件进行显著性和相关性分析，多重比较采用Duncan新复极差法，使用SAS9.0软件进行聚类分析。

二、实验结果

1.酵母菌的分离

TA11TR-1 ^T、TA11TR-4和TA11TR-6这3株酵母菌分离于山东泰安苹果园土壤样品，利用YM液体培养基（含氯霉素200μg/mL）富集培养的方法分离得到。

2.菌株的形态特征

25℃液体培养，细胞呈椭圆形或卵圆形，（2.8～5.2）μm×（4.8～6.0）μm，单独或成对出现。单芽生殖。25℃培养1个月后，底部有沉淀物产生。玉米粉琼脂培养基培养并未长出假菌丝。在稀释（1∶19）琼脂培养基上25℃培养7d，营养细胞可直接转化成含1～2个椭圆形或卵圆形子囊孢子的子囊。

3.菌株的生理特征

（1）糖发酵 测定酵母菌菌株能够发酵葡萄糖和半乳糖，不能发酵麦芽糖、山梨糖、蔗糖和棉子糖。

（2）碳源同化 测定酵母菌菌株能够同化利用葡萄糖和半乳糖，弱同化乙醇和核糖，不能同行利用L-山梨糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、海藻糖、乳糖、蜜二糖、松三糖、棉籽糖、菊粉、可溶性淀粉、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-阿拉伯糖、L-鼠李糖、D-葡糖胺、甲醇、丙三醇、赤藓糖醇、核糖醇、半乳糖醇，D-甘露醇、α-甲基-D-葡萄糖苷、杨梅苷、DL-乳酸、琥珀酸、柠檬酸和肌醇。

（3）氮源同化测定酵母菌菌株能够同化利用硫酸铵，不能同化L-赖氨酸、硝酸钾、亚硝酸钠、盐酸乙胺和盐酸尸胺。

（4）其他生理生化特征测定酵母菌菌株最高生长温度为34℃，裂解熊果苷、尿素酶反应、DBB颜色反应、类淀粉物质、无维生素培养基中生长和50%（质量分数）葡萄糖酵母膏斜面的生长测定均为阴性。

4.鉴定菌株的系统进化分析

TA11TR-1 ^T、TA11TR-4和TA11TR-6的D1/D2、ITS区序列相同。BLAST结果显示，与TA11TR-1 ^T菌株D1/D2区序列最匹配的是Kazachstania servazzii、Kazachstaniaaquatica和分离于泰国的酵母菌株ST-394。约590bp的D1/D2区碱基序列比对表明，与以上三个菌株仅有22～25个碱基（占3.8%～4.2%）不匹配，出现15～17个碱基置换及7～8个碱基缺失。这三个菌株具有非常独特的ITS区序列。ITS1长度为338bp、ITS2区段长度为488bp，使得ITS-5.8S rDNA区（983bp）比以往鉴定的其他子囊菌酵母都要长。在GenBank中输入ITS1或ITS2进行Blast时，总是显示为“未找到与之匹配的信息”。

由于不能罗列出TA11TR-1^T与其他相关的子囊菌酵母的ITS序列，因此运用18S rDNA及D1/D2区序列进行系统进化分析。在由18S rDNA及D1/D2区序列构成的N-J系统进化树上，TA11TR-1 ^T与Kazachstania naganishii及Kazachstania telluris等聚类在同一个分支簇上。菌株TA11TR-1 ^T与已经鉴定的菌种的D1/D2区40～50个碱基（占6.8%～8.5%）不匹配。TA11TR-1 ^TITS序列与邻近种的序列比对并没有表明ITS1及ITS2区过长是由基因的插入引起的。序列分析表明菌株TA11TR-1 ^T、TA11TR-4和TA11TR-6属于Kazachstania属，命名为Kazachstania tainensis sp.nov.。

5.K.tainensis sp.nov.与近缘种生理特征的差异

K.tainensis sp.nov.与K.telluris生理特征的差异在于半乳糖的发酵和同化能力，以及最高生长温度达不到40℃；与K.sinensis和K.naganishii的差异在于不能发酵与同化蔗糖，不能同化L-赖氨酸和尸胺。