以南极一株放线菌新种的分离鉴定为实例说明放线菌新种的鉴定过程。在南极中国长城站附近的土样中，分离纯化得到一株放线菌，有明显的孢子和产孢结构，在高氏一号培养基上气生菌丝和基内菌丝均为白色，菌株编号GW9-2^T，用16S rDNA全长序列与其他已知有效发表种进行比对，最大同源性为97.93%，初步确定其为拟诺卡菌属（Nocardiopsis）的一个新种。拟诺卡菌最早由Meyer描述。目前在南极只分离到一种拟诺卡菌。选取同源性最高的Nocardiopsis lucentensis DSM 44048 ^T、Nocardiopsis flavescens SA6 ^T、Nocardiopsis alba DSM43377^T和Nocardiopsis halotolerans DSM44410^T四株模式菌为参考菌株，从表观特征、化学分类和基因型分类三个方面对菌株GW9-2^T进行验证，包括16S rDNA序列重新测序、生理生化指标和化学组分指标的测定、将其与模式菌进行DNA-DNA杂交、进行电镜观察及（G+C）mol%含量测定等方法，确定菌株GW9-2 ^T是拟诺卡菌属（Nocardiopsis）的一个新种，命名为Nocardiopsis fildesensis sp.nov.。

一、实验材料

1.供试菌株

从南极长城站采集的土样分离纯化得到一株放线菌，有明显的孢子结构，在高氏一号培养基上气生菌丝和基内菌丝均为白色，菌株编号GW9-2 ^T。

2.主要试剂及仪器

（1）主要试剂微量盐溶液、碘液、格里斯试剂、二苯胺试剂、磷酸类脂显色剂（Dittmer and lester钼蓝试剂）、茚三酮溶液（氨基酸显色剂∶0.4g茚三酮溶于100mL丙酮中）、苯胺邻苯二甲酸溶液（糖显色剂∶邻苯二甲酸1.66g，苯胺0.93g，溶于100mL水饱和的正丁醇）。

（2）培养基实验用的LB培养基、察氏培养基、PDA培养基、1/2 ISP2培养基、燕麦培养基、ISP4培养基、甘油-天冬酰胺培养基、淀粉培养基、明胶培养基、H₂S产生培养基、牛乳胨化培养基、脲酶产生培养基、TS B培养基、高氏一号培养基等参考相关文献。

二、实验方法

1.GW9-2^T基因组DNA的提取及16S rDNA的扩增和测序

（1）基因组DNA提取先向1.5mL无菌EP管中加入150μL 1×TE溶液，然后挑取适量菌体放入上EP管中；加入150μL 1×TE溶液，使菌体与缓冲液充分接触。加入40μL浓度为50mg/mL的溶菌酶，吹打菌体，使其混匀，37℃水浴60min，隔半小时将其上下颠倒混匀，使其充分溶解。向EP管中加入30μL浓度为10%的SDS，还有3μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K，混匀后56℃水浴30min；然后向混合物中加入100μL浓度为5mol/L的高浓度盐溶液，轻轻颠倒使其充分混匀。加入等体积（约450mL）的苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1，体积比），混匀后12000×g低温离心5min；将上清液缓慢转移至一新管中，加入等体积（约400mL）异丙醇，混匀后放置30min。然后12000×g离心15min，倒去上清。沿着EP管壁缓慢加入200μL的70%乙醇，清洗管壁，12000×g离心1min，将乙醇倒掉，重复2次。然后将管口打开，放在37℃ 1～1.5h，无酒精味道即可拿出。最后加50μL蒸馏水或TE缓冲液，即为DNA溶液。检测DNA，样品放置于-20℃保存备用。

（2）16S rDNA的扩增与测序以上述提取的菌株DNA为模板，利用16S rDNA特异性引物进行扩增，反应体系（50μL）如下：PCR Mix buffer 25μL，引物1和引物2各1μL，模板DNA 4μL，三蒸水19μL。反应程序为：94℃预变性5min；94℃1min，68℃1min，72℃2min，共30个循环；最终72℃延伸8min。然后把PCR产物直接送测序公司进行序列测定。

2.扫描电镜观察

选取待测菌株纯培养物进行扫描电镜观察，寻找合适的视野，观察菌株菌丝和孢子的形态，并拍照。

3.菌株保藏

将菌株GW9-2 ^T接种斜面，各寄两支至德国DSMZ微生物菌种保藏中心、美国农业农艺调查服务部门保藏中心（ARS）和中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）进行保藏。

4.（G+C）mol%含量测定及DNA杂交

每一种生物的DNA都有特定的（G+C）mol%含量，种内菌株间的G+C含量相差不超过4%，属内菌株间相差不会超过10%。放线菌G+C含量在59%～79%，波动范围一般小于30%。（G+C）mol%含量测定已经成为放线菌新种鉴定的基本方法之一，也是描述分类单位的一个基本特征。测定方法及DNA杂交方法同细菌鉴定的方法。

5.菌株培养特征测定

测定菌株在以下7种培养基上的生长状况：ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、察氏培养基、土豆培养基和营养琼脂培养基。28℃培养2～4周后，观察菌株的表面颜色、基内菌丝的颜色、是否产生色素以及色素的颜色。

6.生理生化性状测定

（1）唯一氮源利用测定利用Biolog GP2微生物鉴定微孔板测定唯一氮源利用指标。

（2）温度耐受试验 将菌株GW9-2 ^T接种在高氏一号培养基上，每个温度接两个平板作为平行样，分别放置在4℃、12℃、16℃、20℃、28℃和37℃下培养2～4周，观察其生长状况。

（3）盐耐受试验 将待测菌株接种在盐浓度不同（0～7%、10%、12%、15%、20%）的基础培养基上，28℃培养2～4周，记录生长情况。

（4）淀粉水解试验 将菌株GW9-2 ^T点种在淀粉水解培养基上，培养1～2周后，在菌落周围滴加碘液，观察是否有水解圈的形成，以此判断菌株是否有淀粉水解酶活力。

（5）明胶液化试验将菌株GW9-2 ^T穿刺接种到明胶培养基试管中，另取两支不接种作为空白对照，于28℃培养箱中培养。每周观察一次，连续培养和观察四周后结束。观察时将试管放入4℃冰箱，30min后取出，此时若试管中培养基呈液体状态则为阳性，若培养基仍为固体状态则为阴性。

（6）牛乳凝固与胨化将测试菌株接种在牛乳试管中，培养1～2周后观察，如果牛乳发生凝固或者胨化现象，为阳性，并取两支不接种试管作为空白对照。

（7）硝酸盐还原试验将菌株GW9-2 ^T接种在硝酸盐液体培养基中，28℃培养。取两管不接种，28℃放置作阴性对照。培养适当时间后，取适量培养液，分别加入等量格里斯试剂A、B液，出现粉红色，则为阳性。如无红色出现，则加1～2滴二苯胺试剂，出现蓝色，表示培养液中仍有硝酸盐存在，为阴性；若不呈蓝色，按阳性结果处理。

（8）脲酶水解试验 将菌株GW9-2 ^T接种在脲酶液体培养基中，取两支不接种作为空白对照。培养2～4周后观察，若液体变为红色，则产生脲酶。

（9）硫化氢产生试验 将菌株GW9-2 ^T接种在硫化氢培养基上，培养2～4周后观察。由于培养基含有柠檬酸铁铵，若菌株能分解产生硫化氢气体，则可以生成黑色沉淀（FeS）。

（10）黑色素的产生 将菌株GW9-2^T接种在酪氨酸培养基上。28℃培养2～4周后观察结果。培养基变成黑色即阳性，不变则为阴性。

（11）唯一碳氮源利用将菌株GW9-2 ^T湿菌体用无菌水冲洗，分别接种在Biolog GP2微生物微孔鉴定板的95个孔中，每个孔中滴加150μL混合均匀的菌液。每个孔对应一种碳氮源，接两个GP2板作为平行样，每隔一周进行观察，连续四周后结束。根据微孔板使用手册，若为阳性，则孔中呈紫色，若为阴性则没有颜色变化。

（12）菌株GW9-2^T细胞化学组分测定

①主要细胞壁糖组分测定

a.菌体制备：直接从斜面或平板上接种，液体摇床培养5～7d，然后将菌体转移至灭菌离心管中，10000×g离心，倒掉上层培养基，用蒸馏水反复冲洗至菌体没有培养基颜色，再用无水乙醇冲洗，然后敞开管口，自然风干。

取30mg湿菌体分装于安培管中，用酒精喷灯进行封口，用于氨基酸分析；另取30mg用于糖组分分析。

b.菌体水解：加入0.5mol/L HCl 0.4mL，封口，120℃水解4h，可根据颜色变化自动调节水解时间。(www.daowen.com)

c.点样：取1μL样品水解液和0.6μL标准品在层析板上点样（标准品含浓度为1%的7种单糖）。等样品风干后，以乙酸乙酯∶吡啶∶冰乙酸∶水=8∶5 ∶1 ∶1.5（体积比）为展层剂开始展开，采用上层法进行2次层析。

d.显色：滴加苯胺邻苯二甲酸溶液进行显色，加热3～4min。

②主要细胞壁氨基酸组分测定（薄层层析法）

a.菌体收集：同上述操作。

b.菌体水解：加入6mol/L HCl 0.2～0.4mL，封口，120℃水解4h左右，当水解液呈现黑褐色时停止水解。

c.点样：取1μL水解液和0.2μL标准品DAP在薄层层析板上点样。

d.展层：以甲醇∶吡啶∶冰乙酸∶水=10∶1∶0.25∶5（体积比）为展层剂，展层2次。

e.显色：喷雾0.4%茚三酮乙醇溶液显色，加热2～3min。

③细胞磷脂的测定：同细菌鉴定实例中的方法。

三、实验结果

1.GW9-2^T基因组提取及PCR扩增

利用SDS-酚-氯仿-异戊醇法提取菌株GW9-2 ^T的基因组DNA。以该DNA为模板，利用16S rDNA特异性引物进行PCR扩增，目的片段大小约1500bp。

2.16S rDNA序列的比对及模式菌株的选取

将菌株GW9-2^T的16S rDNA序列提交到Ez Bio Cloud数据库进行比对，发现与模式菌株Nocardiopsis lucentensis DSM 44048 ^T的最大同源性为97.93%，与菌株Nocardiopsis flavescens SA6^T、Nocardiopsis alba DSM43377^T和Nocardiopsis halotolerans DSM44410^T的同源性分别为97.72%、97.65%和97.43%，因此选取它们作为测试菌株鉴定的标准模式菌株。

将GW9-2^T的序列和同属中相似度较高的菌株序列利用Mega 5.0软件构建分子进化树，发现GW9-2 ^T聚类为独立的分支，与标准模式菌株遗传距离较远，表明该菌株具有一定的独特性。

3.GW9-2 ^T的电镜形态观察

电镜观察发现，菌株有孢子结构，孢子呈球状，直径大小约为（0.6～0.8）μm×（0.8～1.0）μm，表面粗糙，可以形成长的孢子链。

4.菌株保藏

菌株GW9-2 ^T分别在德国DSMZ微生物菌种保藏中心、美国农业农艺调查服务部门保藏中心（ARS）和中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏，菌株保藏号分别为DSM 45699 ^T、NRRL B-24873 ^T和CGMCC 4.7023 ^T。

5.GW9-2^T的（G+C）mol%含量测定及DNA-DNA杂交结果

由于放线菌DNA的G+C含量较高，一般都在59%～79%，其中拟诺卡菌属的含量一般为70%～76%，而测定的菌株GW9-2^T（G+C）mol%含量为76.8%，因此从（G+C）mol%含量上看，GW9-2^T菌株可能属于拟诺卡菌属。

通过与模式菌株N.lucentensis DSM 44048 ^T、N.flavescens SA6 ^T、N.alba DSM 43377 ^T和N.halotolerans DSM44410^T进行DNA-DNA杂交，其复性率仅分别为37.6% ±1.7%、34.9%±1.9%、33.8%±1.8%和33.3% ±1.7%，表明测试菌株与模式菌株不属于同一个种。

6.GW9-2 ^T菌株的培养特征

将菌株GW9-2 ^T分别接种在7种不同培养基上，培养2～4周后，观察其培养特征。发现该菌株仅在ISP2和察氏培养基上生长良好，在ISP4、ISP5和土豆培养基上生长微弱，在ISP3和营养琼脂培养基上不生长，菌体的基内菌丝和气生菌丝在不同培养基上的颜色参照ISCC-NBS颜色图表进行对比。

7.GW9-2 ^T的生理生化特征

菌株GW9-2^T在16℃时微弱生长，在28～37℃生长较好，16℃以下不生长，28℃为其最适生长温度；菌株在pH5～11条件下均能够生长，在pH9～11时生长较好，pH9为其最适生长pH；菌株在含0～12% NaCl的高氏一号培养基上均可生长，在2%～4%NaCl条件下生长最好，为其最适生长盐度。菌株GW9-2 ^T明胶液化、牛乳凝固和胨化、硝酸盐还原、脲酶水解、H₂S产生和黑色素产生等六项生理生化指标为阴性，只有淀粉水解实验为弱阳性。菌株GW9-2 ^T可利用以下碳氮源：肝糖、甘露聚糖、Tween 40、N-乙酰-β-D-甘露糖胺、D-纤维二糖、D-果糖、L-海藻糖、D-半乳糖、葡萄糖酸、α-D-葡萄糖、乳果糖、麦芽三糖、D-甘露醇、D-甘露糖、D-松三糖、D-蜜二糖、3-甲基-D-葡萄糖、异麦芽酮糖、景天庚醛聚糖、蔗糖、D-海藻糖、松二糖、乙酸、α-羟丁酸、β-羟丁酸、α-酮戊二酸、α-戊酮酸、L-乳酸、N-乙酰-L-谷氨酸、D-丙氨酸、L-谷氨酸、L-焦谷氨酸和甘油。

8.GW9-2 ^T的细胞化学组分

（1）全细胞水解液糖分析参考标准菌株新种鉴定文献，除菌株Nocardiopsis flavescens SA6 ^T全细胞糖组分为果糖和核糖以外，菌株GW9-2 ^T和其他三株模式菌均无特征性糖，说明菌株GW9-2 ^T确实可能属于拟诺卡菌属。

（2）全细胞水解氨基酸分析参考标准菌株新种鉴定文献，拟诺卡菌属的全细胞氨基酸成分大部分均为内消旋DAP（meso-DAP）。测定菌株GW9-2 ^T与四株模式菌株的薄层层析结果一致，符合拟诺卡菌属的性状。

（3）磷酸类脂的测定菌株GW9-2 ^T磷脂类脂层析结果参考放线菌系统分类学中磷脂类脂层析各组分位置，并与模式菌的磷酸类脂结果进行比对，可以分析出菌株GW9-2 ^T的细胞中，主要包含PG（磷脂酰甘油）、PC（磷脂酰胆碱）、PME（磷脂酰甲基乙醇胺）和PE（磷脂乙醇胺）。由于拟诺卡菌属的全细胞中，磷脂类脂的主要成分是PG、PC和PE，因此从磷脂类脂上看菌株GW9-2 ^T属于拟诺卡菌属。

（4）脂肪酸的测定测定结果表明，菌株GW9-2^T主要脂肪酸为iso-C16 ∶0（19.3%）、反异式-甲基-分支脂肪酸anteiso-C17 ∶0（12.7%）、ω9c-C18 ∶1（9.3%）、iso-C15∶0（8.3%）和iso-C17 ∶0（8.3%）。参考标准株新种鉴定文献，卢森坦拟诺卡氏菌（N.lucentensis）DSM44048^T主要含有iso-C16∶0、anteiso-C17∶0、10-甲基C18∶0、C18和iso-C18∶0，苦参拟诺卡氏菌（N.flavescens）SA6^T主要含有anteiso-C17∶0、iso-C16∶0、C18∶0和C18∶1ω9c，白色拟诺卡氏菌（N.alba）DSM43377^T主要含有iso-C16∶0、9-cis-C18∶1、anteiso-C17∶0、C18∶0和iso-C14∶0，耐光拟诺卡氏菌（N.halotolerans）DSM44410^T主要含有iso-C16∶0、anteiso-C17∶0、anteiso-C15∶0、C18∶1和C17∶1。由于拟诺卡菌属主要脂肪酸为iso-C16∶0、anteiso-C17∶0和anteiso-C15∶0，因此从脂肪酸组成上看菌株GW9-2 ^T属于拟诺卡菌属。

（5）甲基萘醌的测定测定菌株的主要甲基萘醌为MK-9（H₄）、MK7、MK-10（H₄）和MK-10（H₆）。参考标准株新种鉴定文献，拟诺卡菌属主要甲基萘醌为MK-10（H₄）、MK-10（H₆）和MK-9（H₄），因此从甲基萘醌成分上看菌株GW9-2^T属于拟诺卡菌属。

四、结论

菌株GW9-2 ^T革兰阳性，有孢子结构，分生孢子直径大小为（0.6～0.8）μm×（0.8～1.0）μm，孢子近球状，表面粗糙，不能移动，可以形成长的孢子链。在ISP2和察氏培养基上生长良好，在ISP4、ISP5和土豆培养基上生长微弱，在ISP3和营养琼脂培养基上不生长，不产生可溶性色素，气生菌丝发达，基内菌丝呈白色。GW9-2 ^T在16～37℃都可以生长，最适温度为28°C；GW9-2^T在0～12%的盐浓度环境下可以适度生长，最适盐浓度为3%；其生长的pH范围为5～11，最适生长pH为9。淀粉水解试验结果呈弱阳性，其他生理生化试验结果均为阴性。可利用的碳源范围较广：肝糖、甘露聚糖、Tween 40、N-乙酰-β-D-甘露糖胺、D-纤维二糖、D-果糖、L-海藻糖、D-半乳糖、葡萄糖酸、α-D-葡萄糖、乳果糖、麦芽三糖、D-甘露醇、D-甘露糖、D-松三糖、D-蜜二糖、3-甲基-D-葡萄糖、异麦芽酮糖、景天庚醛聚糖、蔗糖、D-海藻糖、松二糖、乙酸、α-羟丁酸、β-羟丁酸、α-酮戊二酸、α-戊酮酸、L-乳酸、N-乙酰-L-谷氨酸、D-丙氨酸、L-谷氨酸、L-焦谷氨酸和甘油。全细胞主要糖组分为无特征性糖，胞壁肽聚糖包括的氨基酸为meso-DAP，主要磷脂类脂成分有PG、PC、PME和PE，主要脂肪酸有iso-C16 ∶0（19.3%）、anteiso-C17 ∶0（12.7%）、ω9c-C18 ∶1（9.3%）、iso-C15∶0（8.3%）和iso-C17 ∶0（8.3%），主要甲基萘醌有MK-9（H₄）（31%）。（G+C）mol%含量为76.8%。与模式菌株卢森坦拟诺卡氏菌DSM44048^T、苦参拟诺卡氏菌SA6^T、白色拟诺卡氏菌DSM43377^T和耐光拟诺卡氏菌DSM44410^T进行DNA-DNA杂交，其相似度仅分别为（37.6 ±1.7）%、（34.9 ±1.9）%、（33.8 ±1.8）%和（33.3 ±1.7）%。根据以上培养特征、生理生化实验和化学组分测定结果，结合该菌株16S rDNA序列同源性比对结果，确定菌株GW9-2^T为拟诺卡菌属的一个新种，命名为Nocardiopsis fildesensis sp.nov.。