以根瘤菌新种——木垒中慢生根瘤菌（Mesorhizobium muleiense）为实例来说明细菌新种的鉴定方法。对于根瘤菌新种的鉴定，首先待鉴定的菌株数量至少应大于等于两株。而木垒中慢生根瘤菌新种鉴定的供试菌株有CCBAU 83963、CCBAU 83939和CCBAU 83908三株，其中CCBAU 83963代表了之前研究的新疆最大的鹰嘴豆根瘤菌基因群体。该菌株也被选择作为待鉴定种群的中心菌株，当然它也会被作为鉴定命名的新种群的模式菌株。对该种的鉴定采用了传统分类方法与现代系统学方法相结合的方法。

一、实验方法

1.实验菌株的收集

实验菌株主要包括疑似新种的供试菌CCBAU 83963、CCBAU 83939和CCBAU 83908，以及在16S rDNA系统发育分析中与供试菌相似性大于97%的中慢生根瘤菌属的已知种的模式菌株。所需要的模式菌株可以通过中国农业大学根瘤菌研究中心的CCBAU根瘤菌库、中国科学院微生物菌种保藏中心（CGMCC）等菌种保藏机构索取或购买。获得研究菌株后，首先要进行16S rDNA基因的测序和比对分析，确保获得菌株的正确与否。

2.培养基的制备

培养根瘤菌所用的经典培养基为YMA（yeast-D-mannitol agar）培养基和TY（tryptone-yeast）培养基。进行数值分类实验时需要用到White培养基、产H₂S培养基、V-P测定用培养基、淀粉水解实验用培养基等。

3.鉴定的方法步骤

（1）16S rRNA基因及持家基因的扩增、序列测定及系统发育分析基因扩增的相关信息见表8-1。PCR产物经过1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，送测序公司进行序列测定，其中16S rRNA基因测序采用的是两端测序的办法，测序结果还需要通过DNAMAN软件的sequence assembly功能进行完整序列的拼接；而其余几个基因则采用正向引物单端测序的办法。

表8-1 扩增相关基因及引物信息

对测序结果预处理后，选择相应的参比菌株进行系统发育分析。其中16S rRNA基因采用了最大似然法（maximum likelihood，ML），用的计算模型为K2 +I+G，bootstrap值为1000。而三个持家基因则采用邻接法（neighbor joining method，NJ），用的计算模型为K2，bootstrap值也为1000。

（2）全细胞可溶性蛋白SDS-PAGE分析

①菌种样品的准备：将所有供试菌株先在M-YMA平板上活化，然后分别从平板上接入TY液体培养基内，28℃恒温摇床振荡培养4～5天，镜检培养物的纯度。将纯培养物转入已称重的无菌1.5mL离心管内，以10000r/min离心2min收集菌体。然后用1×TES离心洗涤菌体3次，并用枪头吸干净上清。再次称重含有菌体的离心管，计算出菌体的质量。最后用无菌的双蒸水悬浮菌体，使菌体的浓度为40mg/mL，保存于-20℃冰箱中备用。

②热煮沸法准备SDS-PAGE上样样品：取40mg/mL的菌悬液加入等体积的2×样品缓冲液，混合均匀后盖好盖子，用夹子固定盖子，在100℃沸水浴中煮沸变性10min。变性后的样品，保存于-20℃冰箱内。

③聚丙烯酰胺凝胶的制备：实验采用不连续电泳系统，浓缩胶和分离胶的浓度分别为5%和15%。

④上样与电泳：将准备好的样品从-20℃冰箱取出，置冰上融化，再经过沸水浴变性5min处理，冷却至室温后上样。上样量为8μL，电泳的缓冲液为pH8.8的Tris-甘氨酸溶液。在电压为80V下完成全蛋白样品在浓缩胶中的浓缩。待溴酚蓝前沿进入分离胶时，加大电压到300V，继续电泳6h。为了防止因电泳产生过多的热量导致电泳不均匀，要做好降温处理：上样后，将电泳槽放入4℃冰箱内，整个电泳过程在冰箱中恒温完成。

⑤凝胶染色和结果获取：实验采用高灵敏度的银染法。操作的全过程要求使用去离子水和戴一次性手套，并且所用的器皿也要先用盐酸浸泡，再用去离子水冲洗干净。电泳结束后，打开玻璃片，使凝胶暴露出来。用干净的刀片小心地切除浓缩胶，把剩余的分离胶转入盛有固定液的直径约300mm的玻璃培养皿内，室温下在摇床上温和摇动过夜固定，以促进胶上蛋白质的沉淀，同时使SDS从凝胶中扩散出来。固定完成后，弃去固定液，加入浸泡液，室温下温和摇动30min；用去离子水洗胶3次，每次5min；弃去洗胶用的去离子水，加入新配制的硝酸银染色溶液，在摇床上黑暗条件下温和摇动染色20min，弃去染色液后再用去离子水冲洗凝胶的两面3次，每次约10s；弃去去离子水，并加入显色液，将一张白纸放在玻璃培养皿下边作为背景，在摇床上缓慢摇动，显色数分钟。染色过程中要一直观察，待蛋白条带颜色深浅适宜时，立即加入终止液终止染色10min以上。最后，弃去终止液，并加入10%甘油，浸泡大约30min，然后用扫胶仪获取照片。

（3）基因组DNA（G+C）mol%含量测定与DNA同源性分析

①菌体培养和收集：将冰箱保存菌株接种至M-YMA平板上活化培养，然后接种200mL TY液体培养基，28℃ 180r/min振荡培养。待培养至对数生长中后期时，镜检确认没有污染杂菌。将培养菌液分装于无菌的50mL离心管，4℃ 5000r/min离心20min收集菌体，用无菌的1×TES或者0.85%生理盐水悬浮菌体。相同条件下离心洗涤菌体3次。

②根瘤菌基因组总DNA的大量提取：以20mL/2g湿菌体的标准向洗涤收集的菌体内加入1×TES，重新振荡混匀悬浮菌体，然后向菌悬液内加入50mg/mL的溶菌酶0.25mL，混匀后置37℃恒温水浴摇床上，以80r/min的转速振荡反应30～60min；从摇床上取下离心管，向菌悬液内加入1/10体积的20% SDS溶液，混匀后55℃恒温水浴静置保温10min，水浴后在空气中缓慢冷却至室温；向体系中加入200μL蛋白酶K溶液，混匀后55℃水浴摇床温和振荡30～60min；反应结束后，向体系中加入5mL NaClO₄溶液，混合均匀；向体系中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇混合溶液（25∶24∶1，提前配好并在4℃冰箱中静置保存过夜），加好离心管盖子，然后室温下在摇床上充分振荡（约振荡20min）使其呈乳浊液，再4℃5000r/min离心20min，分离有机溶剂相和水相。离心后，用大口枪头将上清小心地转移到一个干净离心管内（不要吸到下层有机相）。然后，加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇混合溶液，如前所述重复抽提3～5次，直至两相间没有蛋白膜出现为止。最后一次抽提并离心后，将上清小心地转移到一干净的离心管中，然后加入RNase使得酶的终浓度达到60μg/mL，37℃恒温水浴保温30～60min。最后向体系中加入等体积的氯仿∶异戊醇（24∶1）混合溶液，室温下充分振荡20min，然后4℃ 5000r/min离心20min，将上清小心地转移到小烧杯中，并立即放冰上预冷，然后向烧杯中加入1/10体积的预冷的3mol/L NaAc-1mmol/L EDTA-Na₂及等体积的冷异戊醇，轻轻摇动混匀，冰浴沉淀DNA，并用干净无菌的玻璃棒在烧杯的液体中缓缓转动，缠起沉淀析出的DNA，并小心地放入盛有70%乙醇的小离心管内，封口并做好标记后，于4℃冰箱中过夜，以去除无机盐和有机溶剂；从70%的乙醇中取出缠有DNA的玻璃棒，放入盛有95%乙醇的小离心管内脱水10min；取出玻璃棒，室温下风干DNA；最终将风干的DNA溶解到1mL 0.1×SSC溶液中。

③基因组总DNA的浓度和纯度的检测：在分光光度计上，将上步得到的基因组总DNA溶液首先调节浓度到A₂₆₀=0.2～0.5，然后分别测量230nm、260nm和280nm三个波长下的吸收值（A），如果A₂₆₀∶A₂₈₀∶A₂₃₀≥1∶0.515∶0.450，说明DNA样品是合格的；倘若A₂₃₀和A₂₈₀与A₂₆₀的比值分别大于0.450和0.515，则得到的DNA样品需要重复提取过程中的去除蛋白或者去除RNA的步骤，直至三个波长下吸收值的比值符合条件为止。DNA浓度要求A₂₆₀≥2.0，即不低于100μg/mL。

④基因组总DNA的T_m值及G+C含量的测定：采用热变性温度法测定基因组总DNA的T_m值及（G+C）mol%含量。

由于T_m值的测定受离子强度影响较大，要求所有供试菌株的基因组总D N A样品的溶解和稀释使用来自同一批次配制的10×SSC母液，这样可以很好地消除实验的系统误差。供试菌株的基因组总DNA用0.1×SSC溶液调节浓度至A₂₆₀=0.2～0.5；同时采用E.coli K-12菌株的基因组总DNA作为参比，以消除测定仪器和温度等系统误差。测定仪器由三部分组成，即Lambda Bio 35型紫外分光光度计（PE公司），PTP-1温度控制仪及水浴循环仪。测定过程由Lambda Bio 35和Templab等软件自动控制：起始温度为65℃，终止温度为95℃，温度为每分钟升高1℃，且每隔0.1℃测量一次A₂₆₀值。当测定过程结束后，软件会自动给出测试DNA的T_m值。然后按照在0.1×SSC溶液中的下列公式计算（G+C）mol%。

（G+C）mol% =51.2 +2.08×（T_mX-T_mR）

式中，T_mX为待测菌株DNA的T_m值；T_mR表示E.coli K-12基因组DNA的T_m值。

⑤基因组总DNA的液相杂交：采用液相复性速率法测定基因组总DNA的同源性。

a.样品DNA的剪切：将检测合格的待测DNA样品用同一来源的0.1×SSC缓冲液调节，使A₂₆₀=2.00左右。取3mL的样品置于无菌的离心管中，在细胞超声波破碎仪上进行剪切。设置输出功率40W，然后以超声破碎3s，间隔4s的模式在冰浴中进行DNA的剪切，共剪切90次。剪切结束后，将样品反复颠倒几次以混匀样品。同样条件下，重复该超声破碎过程4次。剪切结束后，在1%的琼脂糖凝胶上电泳检测，此时剪切后的DNA样品的片段大小应该集中在300～800bp的范围。

b.DNA变性和复性速率的测定

（a）将剪切好的DNA样品以每毫升DNA样品加入0.24mL 10×SSC缓冲液为标准，调节缓冲液为2×SSC的体系。杂交过程为：首先用2×SSC缓冲液进行杂交仪系统调零，然后取0.4mL用于杂交的单个DNA样品分别进行自身复性试验，最后把要杂交的两个样品各取0.2mL混合均匀，放入比色杯中，并插入温度传感器探头，用温度控制仪（PTP-1）控制杂交的温度。

（b）DNA样品均在98～100℃变性15min，然后人工调节温度到复性温度。复性温度取决于根瘤菌不同属的（G+C）mol%含量。复性温度计算的公式为：T_or=47.0+0.51×（G+C）mol%。当盛样品的比色杯温度降至最适复性温度时，Lambda Bio 35紫外分光光度计开始实时测定A₂₆₀值，计算机上软件记录并计算和显示吸收值随时间变化的曲线，即复性曲线，该曲线的斜率即为DNA样品的复性速率。复性反应过程持续30min。

（c）DNA-DNA同源性的计算

根据下面的公式，计算DNA-DNA同源性H%：

式中，V_A和V_B分别表示样品A和B的自身复性速率；V_m表示样品A和B等量混合后的杂交复性速率。

（4）表型性状的测定

①唯一碳源的利用：选用47种碳源来测定供试菌株的利用能力。碳源分别配制成1%的溶液，除了不耐高温的半乳糖、D-核糖、尿素和木糖等采用过滤除菌外，其余的均在8bf/in²（1bf/in²=6894.76Pa）灭菌20min。测试碳源C1～C47分别罗列如下：己二酸、D-阿拉伯糖醇（D-树胶糖醇）、D-阿拉伯糖（D-树胶醛糖）、菊糖、葡萄糖酸钙、丙二酸钙、糊精、半乳糖醇（甜醇）、内消旋赤藓醇、D-苦杏仁苷、D（+）-半乳糖、无水葡萄糖、肌醇、D-果糖、乳糖、dl-苹果酸钠、麦芽糖、蜜二糖、D-松三糖、D-甘露糖、丙酮酸钠、棉子糖、L-鼠李糖、水杨苷（水杨素）、D-核糖、乙酸钠、柠檬酸钠、甲酸钠、D-葡萄糖酸钠、马尿酸钠、琥珀酸钠、D-山梨糖醇、山梨糖、淀粉、蔗糖、丁香酸、酒石酸钠、海藻糖、香草酸、D-木糖、L-精氨酸、甘氨酸、dl-天冬酰胺、L-脯氨酸、松二糖、L-甲硫氨酸、L-苏氨酸。

将CS7微量元素液按照1%的体积比与White培养基的A组分混合均匀，并以45mL的量分装后灭菌。向灭过菌的碳源溶液5mL中加入White培养基的B组分0.375mL，混合均匀后，加入冷却至55℃左右的上述灭菌的White A培养基中，使碳源的终浓度为1g/L（质量体积分数），在超净台内混合均匀并倒平板。

离心收集培养好的菌体，并用生理盐水洗涤三次，最终用生理盐水悬浮菌体，调配菌悬液为大约10⁸个/mL。然后菌悬液按照记录的顺序加入灭菌的多孔磁盘的孔内，用无菌的与多孔磁盘配套的多点接种器将孔内的菌悬液对应地接种于含不同碳源的培养基平板上，以M-YMA平板为阳性对照接种，同时以不加任何碳源的White培养基平板为阴性对照。接种后，待菌液被吸收后，所有平板28℃倒置培养4d。培养4d后，每天观察结果。待菌落大小适宜时，取出记录结果。

②唯一氮源的利用：共选取14种氮源，测定其被供试菌利用的能力。N1～N14分别为dl-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-胱氨酸、D-谷氨酸、L（+）-谷氨酸、次黄嘌呤、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-苯丙氨酸、D-苏氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸、L-苏氨酸。

培养基的配制与碳源测定基本相同，要将White培养基A组分内的NaNO₃换成所要测定的氮源，使终浓度为1g/L，并且加入10g/L的甘露醇作为碳源，另外所用琼脂粉要用高质量的无氮的纯化琼脂粉，以M-YMA平板为阳性对照，无氮平板为阴性对照。菌株的接种及结果的观察同碳源利用实验。

③对抗生素抗性的测定：实验选用9种抗生素，每种抗生素设定4个浓度梯度。所选抗生素为：新霉素（neomycin）、硫酸链霉素（streptomycin sulfate）、壮观霉素（spectinomycin）、硫酸卡那霉素（kanamycin sulfate）、氨苄青霉素（ampicillin）、红霉素（erythromycin）、庆大霉素（gentamycin）、氯霉素（chloramphenicol）和四环素（tetracycline）。首先溶解上述抗生素，除了氯霉素和红霉素溶剂为乙醇，其他均溶于去离子水中，稀释至适当浓度，并过滤除菌备用。测定抗生素抗性所用的基础培养基为M-YMA。加入抗生素的方法为：灭菌的培养基冷却至55℃左右，加入相应的抗生素，使终浓度分别为5μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和300μg/mL，与培养基混合均匀后，倒平板，做好标记，包括抗生素的种类和浓度。以不加抗生素的M-YMA平板作为阳性对照。菌株的接种、培养、结果观察和记录等方法同上。

④耐盐性检测：测定供试菌株对以下5种NaCl浓度的耐性：1%、2%、3%、4%和5%，所用基础培养基为M-YMA，分别配制含相应NaCl浓度的基础培养基并灭菌和倒平板。以正常的M-YMA平板为阳性对照。菌株的接种、培养、结果观察和记录等方法同上。

⑤耐酸碱性分析：用M-YMA作为基础培养基，在倒平板前，用灭菌的0.1mol/L HCl和NaOH调节pH为4.0、5.0、9.0和10.0，以pH为7.0的M-YMA平板为阳性对照。菌株的接种、培养、结果观察和记录等方法同上。

⑥生长温度范围的测定：选用4个温度即4℃、10℃、37℃和60℃进行测定，并且以28℃作为阳性对照温度，培养基平板均为M-YMA。菌株的接种、培养、结果观察和记录等方法同上。

⑦过氧化氢酶（触酶）活性试验：将供试菌接种于M-YMA平板上，在28℃培养一周后，在菌苔上滴加1mL 3%的H₂O₂溶液，并且当即开始计时观察结果，5min出现气泡的菌株即为过氧化氢酶阳性，不出现气泡的为阴性。

⑧氧化酶活力测定：供试菌在M-YMA平板上活化培养，以幼龄菌苔为最佳。放一片新华滤纸片到洁净的培养皿内，然后滴加1%的四甲基对苯二胺盐酸溶液润湿滤纸片，最后用无菌牙签挑取幼龄的菌苔在滤纸片上划线，并开始计时，10s内变紫色者为阳性，不变色者为阴性。

⑨硝酸盐还原反应：硝酸盐还原培养基以5mL/管分装到试管中，然后在121℃灭菌30min。向试管培养基内接种供试菌株，在28℃培养并分别在第2d、第5d和第7d后检查硝酸盐还原情况，以不接菌的培养基为阴性对照。检查方法为：向瓷白色比色器皿中加入一滴菌液，再加入Griess试剂A、B液各一滴，呈现橙色的为反应阳性；如果不出现橙色，则要加入1～2滴二苯胺试剂进一步检查，如果出现蓝色反应，则记为反应阴性，否则仍然记录为反应阳性。

⑩肉汤生长试验：首先将肉汤蛋白胨培养液以5mL/管分装到试管中，121℃灭菌30min。接种则用接种环挑取少许的菌苔接于培养液内，以不接菌的培养液为阴性对照，在28℃恒温培养箱内培养5d后观察和记录结果，根据培养液是否浑浊判定是否生长。

⑪水解淀粉测定试验：向R2A培养基内添加淀粉，使终浓度为0.2%，混匀后倒平板。向平板上划线接种供试菌，并在28℃恒温培养箱中培养一周后取出，向平板上滴加卢卡碘液，菌落周围如果不显蓝色或者显蓝色但是比周围蓝色浅，则记录为淀粉水解阳性。

⑫ Voges-Proskauer（V.P.）测定实验：葡萄糖蛋白胨水培养基内接入活化的待测菌株，28℃恒温摇床振荡培养2～6d后，取出培养液与40% NaOH溶液等量混合，并加入少许肌酸（可用α-萘酚代替）混合均匀，10min后若培养液出现红色，记为试验阳性。(www.daowen.com)

⑬产硫化氢（H₂S）试验：用无菌接种环挑取活化后的待测菌株，沿着硫酸亚铁琼脂培养基试管管壁穿刺接种，以不接种的空白培养基作为阴性对照，在28℃培养1～2d后，观察记录试验结果。如果培养基变黑色，记录为产硫化氢阳性，不变色则记为阴性。

⑭ BTB产酸产碱反应：用溴百里麝香草酚蓝（BTB）配制0.5%的乙醇溶液，然后按照0.5%（体积分数）的终浓度加入M-YMA培养基中，调pH到7.0，此时培养基呈现草绿色。培养基121℃灭菌30min。倒置平板，将供试菌株点入平板上，每个皿点三点，在28℃下培养3～7d后观察结果：产酸变黄或者产碱变蓝为阳性，不变色的即为不产酸碱的菌株，记为阴性。

⑮对染料刚果红（Congo red）的抗性：刚果红按照一定的浓度溶于热水中，然后加入基础培养基M-YMA，使终浓度为0.1%，混合均匀并灭菌和倒平板。菌株的接种、培养、结果观察和记录等方法同抗生素抗性测定实验。

（5）供试菌株脂肪酸含量的测定

①供试菌株样品的准备：首先将供试菌株包括鹰嘴豆根瘤菌代表菌株和参比菌株在M-YMA培养基平板上活化；从平板接种到TY液体培养基中，在28℃恒温摇床上振荡培养至对数生长中期；用无菌的50mL离心管在5000r/min的转速下离心收集菌体，并用灭过菌的生理盐水离心洗涤菌体3次，最终用无菌的移液器移除上清。

②样品的皂化：取干燥、无菌且带有螺旋盖子的规格为13mm×100mm的玻璃试管，然后按照增量法用无菌的长把小铲子将大约40mg上步得到的湿菌体转移到试管底部，然后加入1mL皂化试剂，拧紧螺旋盖并用漩涡仪振荡试管5～10s，让菌体充分分散。待所有样品如上述步骤加好皂化试剂后，将盛样品和皂化试剂的试管放入试管架上，并将试管架放入沸水浴中（95～100℃）加热5min，然后取出试管架，在室温下轻微冷却，再次振荡试管5～10s，并再次放入沸水浴中。此时，要检查试管是否密封完好，方法为：观察试管底部的液体中是否有气泡产生，如果有气泡，需要检查螺旋盖是否拧紧；如果仍然产气泡，此时，必须取出样品，室温下自然冷却后将样品用移液器转移到新的同样规格的干燥无菌的试管底部。全部检查密封性完好后，继续计时煮沸样品25min。样品一共在水浴中皂化了30min，时间到后取出试管架，并且在室温下自然冷却。

③样品的甲基化：当样品皂化并冷却至室温后，打开螺旋盖，向样品中加入2.0mL甲基化试剂，然后，拧紧螺旋盖并振荡5～10s混匀，之后在80℃的水浴中加热10min，计时结束后，快速将试管架取出并放入事先准备好的盛有自来水的容器内降温。该步骤要严格控制水浴的温度及时间，以避免羟基酸和环式脂肪酸等受到破坏。

④样品的萃取：向冷却的甲基化的样品中加入1.25mL萃取试剂，拧紧盖子并振荡10min；静置分层后，用洁净的移液管小心地移除掉下层的水相部分，留下上层的有机相。

⑤脂肪酸组分的测定：首先向剩余有机相中加入3mL洗涤试剂和几滴饱和的NaCl水溶液，拧紧盖子振荡5min，并在2000r/min下离心3min，然后用洁净的移液器小心吸取和转移约2/3的上层有机相到洁净的GC样品小瓶子内（注意不能吸到下层水相，样品可以在4℃冰箱中保存数日）。最后，使用MIDI Sherlock微生物鉴定系统（Sherlock license CD v 6.0）分析供试菌株的脂肪酸组成成分及含量，将结果在数据库TSBA6中比对，从脂肪酸的角度提供细菌分类地位的相关信息。

（6）极性脂种类的鉴定

①供试菌株的培养和菌体的收集：将供试菌在M-YMA平板上活化培养，接种于M-YMA液体培养基中，在28℃恒温摇床上振荡培养至对数生长后期，然后用无菌的离心管以5000r/min的转速离心收集菌体，并用生理盐水洗涤离心3次。

②样品极性脂的提取：将大约200mg湿菌体转移到容积为40mL带有螺纹盖的洁净的离心管底部，用玻璃移液管向试管中加入15mL甲醇，拧紧盖子并振荡混匀；在约100℃的沸水浴中煮沸5min，取出离心管自然冷却至室温；加入10mL氯仿和6mL 0.5% NaCl，拧紧盖子，在室温下的小摇床上高速剧烈振荡10min，8000r/min离心10min，静置分层并吸取下层到旋转蒸发仪的旋转圆口瓶里，用减压旋转蒸发仪在40℃下浓缩抽干；然后，分两次加入氯仿/甲醇混合液（2∶1，体积比），每次加入200μL，并用混合液冲洗器壁多次，使脂类完全溶解下来，脂类溶解液吸取到1.5mL EP管内，然后8000r/min离心10min，去除沉淀。如果发现出现分层现象，去除上层的泡沫，样品保存于4℃冰箱备用。

③提取样品中磷脂的初步鉴定：使用青岛化工生产的10cm×10cm H板，用铅笔在H板底部大约1cm处划线标记，作为点样线，在横线中点处点加7～8滴样品溶液，配制展层剂，即氯仿∶冰醋酸∶甲醇∶去离子水=80∶18∶12∶5（体积比）四种有机溶剂的混合液，都是HPLC级的，需要现用现配；然后将展层剂注入层析槽内，将点加样品端朝下放入展层剂内，斜靠在玻璃壁上，密闭层析。层析结束后，让H板自然风干，用钼蓝试剂喷雾显色，最后根据蓝色斑点初步分析提取的磷脂是否成功以及含量的大小。

④提取样品双相薄层层析：使用相同规格的H板，用铅笔在H板距离底边与侧边1.5cm×1.5cm处做点标记，作为点样处；在对角的两边分别在离边1.5cm处划线，作为两相层析的顶边线。在层析缸中，使用氯仿∶甲醇∶蒸馏水=14∶6∶1（体积比）混合液作为第一相的展开剂，当第一相层析至顶边1.5cm的标记线处时，取出层析板，自然风干后使用吹风机逐行吹干；然后用氯仿∶甲醇∶冰醋酸=13∶5∶2（体积比）作为第二相展层剂，再次密闭层析，待层析至第二相层析顶边标记线处，取出展板，自然风干。

⑤样品双相层析结果的显色：在抽风工作台内，距离H板10～15cm处用气泵压缩喷雾显色试剂。

a.钼蓝显色：以不喷湿H板为宜，无需加热，着色后立即出现的蓝色斑点即为磷酸类脂质。

b.茴香醛显色：喷雾显色剂后，在110℃下加热6～10min，显示黄绿色斑点且钼蓝试剂显色为蓝色的为含糖的磷脂。

c.α-萘酚显色：喷雾显色剂后，在100℃加热3～5min，显示红色斑点的为糖脂。

d.茚三酮显色：喷雾显色剂后，在100℃加热6～10min，显示红色斑点则表明含有氨基结构。该显色过程可以对含有葡萄糖胺的PE（磷脂酰乙醇胺）、PME（磷脂酰甲基乙醇胺）和未知的磷脂特异性显色，但是不能对含有氨基的PC（磷脂酰胆碱）特异性显色。

e.磷脂组成分析：因为细菌所含磷脂种类的多样性，没有任何一种显色剂可以用来显色所有的组分，需要用几种显色剂相互显色和比较。方法为：同一样品做三个展层，第一块展层板用于钼蓝试剂的显色，蓝色斑点包括磷脂、含糖磷脂、含氨基的磷脂以及其他磷脂；第二块展层板则先用茴香醛试剂显色，记录显色位点后，然后用钼蓝试剂显色，再记录显色位点，并跟第一块展层板比较，蓝色斑点为磷脂[PI（磷脂酰肌醇）、PC（磷脂酰胆碱）、PE、PME及其他类型的磷脂]，而黄色斑点且钼蓝显色呈蓝色的为含糖的磷脂；第三块展层板先用茚三酮试剂显色，斑点为红色的是含有氨基结构或者含有葡萄糖胺的磷脂，记录位点后，再用钼蓝试剂显色，同样记录位点后与第一块展板比较，蓝色斑点在PE和PME的位置先显红色然后显蓝色的就是PE或者PME。含氨基的PC与茚三酮不发生反应，因此，不显红色。先显示红色而钼蓝显色后不再显蓝色的是糖脂。

（7）交叉结瘤试验 需要检测标准菌株与苜蓿（Medicago truncatula）、三叶草（Trifolium pretense）、豌豆（Pisum sativum）、蚕豆（Viciafaba）、菜豆（Phaseolusvulgaris）、紫云英（Astragalussinicus）、大豆（Glycinemax）和豇豆（Vigna unguiculata）的交叉结瘤状况。

二、实验结果

1.16S rRNA基因和持家基因的系统发育分析

16S rRNA基因作为细菌进化的标尺，通过该序列可以快速确定菌株在属水平上的定位。选用中慢生根瘤菌属的22个已知种群模式菌株与三个代表菌株的16S rRNA基因，以菌株豌豆根瘤菌（R.leguminosarum）USDA 2370^T的16S rRNA基因作为外分支，用MEGA 5.05软件，选择K2+I+G模型构建16S rRNA基因序列的ML系统发育树。从系统发育树上可以看到，代表菌株聚为独立的一群，相似性为99.8%；距离较近的菌株有刺槐中慢生根瘤菌（M.robiniae）CCNWYC 115^T、温带中慢生根瘤菌（M.temperatum）SDW018^T和地中海中慢生根瘤菌（M.mediterraneum）LMG 17148^T，并且除了硫自养恒河平原中慢生根瘤菌（M.thiogangeticum）SJT^T之外所有中慢生已知种的相似性都不低于97%，而与外分支豌豆根瘤菌USDA 2370^T的距离较远。所以，代表菌株属于中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium）。

多位点序列分析是将几个持家基因序列按照一定的顺序串联合并后形成一个新的长序列，然后对新序列进行系统发育分析进而研究细菌的进化。该方法在根瘤菌分类学和系统发育学研究中广泛应用。从三个持家基因atpD、recA和glnII的MLSA系统发育树可以看到，鹰嘴豆根瘤菌的三个代表菌株聚为一个不同于其他中慢生根瘤菌属已知种的独立群，且三个代表菌株之间的相似性为97.9%～99.5%，遗传距离较近的种的相似性水平分别为温带中慢生根瘤菌（96.0%～96.5%）、地中海中慢生根瘤菌（95.0%～995.6%）和刺槐中慢生根瘤菌（94.0%～94.7%），且持家基因的MLSA树很好地支持了16S rRNA基因的系统发育结果。

2.全细胞可溶性蛋白SDS-PAGE分析

SDS-PAGE法广泛用于研究样品的蛋白质组成的差异。细菌样品的SDS-PAGE分析，可以得到不同细菌菌株在特定生理条件下的蛋白质组成图谱，显示出不同细菌种表达蛋白种类的差异，用于区分不同种的细菌。三个待测菌株CCBAU 83963、CCBAU 83939和CCBAU 83908的全细胞蛋白图谱非常相似，表现出与其他中慢生参比菌株蛋白图谱的不同，说明待测菌株可能代表了一个中慢生根瘤菌属的新种群。从全细胞蛋白电泳结果的UPGMG聚类树可以看出，在约97%的相似性水平下，内参菌株被划分为一个种的分支。可以得出，所有中慢生根瘤菌属的种均被很好地分开，并且鹰嘴豆根瘤菌的三个代表菌株在种水平上很好地聚为一个独立的群。地中海中慢生根瘤菌USDA 3392^T相似性很高，接近97%，由此可以推测三个代表菌株应该代表一个中慢生根瘤菌属的新种群。

3.基因组DNA的同源性分析和（G+C）mol%含量的测定结果

DNA的（G+C）mol%含量测定结果显示三个代表菌株的含量在60.6%～61.2%的范围内，而中慢生根瘤菌属的（G+C）mol%含量在59%～64%的范围内，表明三个代表菌株属于中慢生根瘤菌属。

DNA-DNA杂交是在种的水平鉴定细菌的一个“黄金法则”。该研究选取新疆鹰嘴豆根瘤菌的三个代表菌株进行群内基因组DNA的自杂交，然后选取CCBAU 83963 ^T作为代表，又与中慢生根瘤菌属的20个已知种的模式菌株分别进行DNA杂交。这20个种的16S rRNA基因跟三个代表菌株的相似性均大于97%，CCBAU 83963 ^T与CCBAU 83908和CCBAU 83939的群内DNA杂交结果分别为99.88% ±0.17%和97.02% ±2.66%，杂交值都大于70%的定种标准，表明三个代表菌株应归属同一个种；CCBAU 83963 ^T与20个中慢生参比菌株的DNA杂交值在15.28%～50.97%，明显小于70%的标准，进一步表明三个代表菌株代表了中慢生根瘤菌属的一个新种。

4.代表菌株的表型特征和数值分类结果

选择鹰嘴豆根瘤菌代表菌株CCBAU 83963^T和中慢生根瘤菌属中16S rRNA基因相似性最大的8个种的模式菌株，即温带中慢生根瘤菌SDW 018^T、锦鸡儿中慢生根瘤菌（M.caraganae）CCBAU 11299^T、天山中慢生根瘤菌（M.tianshanense）CCBAU 3306^T、戈壁中慢生根瘤菌（M.gobiense）CCBAU 83330^T、刺槐中慢生根瘤菌CCNWYC 115^T、耐重金属中慢生根瘤菌（M.metallidurans）LMG 24485 ^T、塔里木中慢生根瘤菌（M.tarimense）CCBAU 83306^T和地中海中慢生根瘤菌USDA 3392^T，进行唯一碳源的利用、唯一氮源的利用和对抗生素的抗性实验。结果表明，CCBAU 83963 ^T可以利用D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、菊糖、葡萄糖酸钙、内消旋赤藓醇、D（+）-半乳糖、葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、D-核糖、乙酸钠、D-山梨糖醇、蔗糖、海藻糖、D-木糖和L-脯氨酸作为唯一的碳源生长，而不能利用D-松三糖和己二酸。同时，CCBAU 83963 ^T可以利用L-精氨酸、L-胱氨酸、DL-α-丙氨酸、次黄嘌呤、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸和L-苏氨酸作为唯一的氮源生长，而不能利用L-天冬氨酸、D-谷氨酸、L（+）-谷氨酸、L-苯丙氨酸和D-苏氨酸。同时CCBAU 83963 ^T可以分别在含有5μg/mL新霉素、硫酸卡那霉素、庆大霉素、氯霉素或者四环素的M-YMA平板上生长，并且能在含有300μg/mL红霉素的M-YMA平板上生长。

5.代表菌株的生理生化试验结果

新疆鹰嘴豆根瘤菌代表菌株CCBAU 83963 ^T能够在pH范围为6～9的M-YMA平板上生长，最适宜的pH为6～8。4℃、10℃、37℃和60℃处理10min都不能生长，最适宜生长温度为28℃。在含有0.1% BTB的M-YMA平板上可以生长并产酸。能在含有0.1%刚果红的M-YMA平板上生长。有过氧化氢酶活力和弱的淀粉酶活力，没有氧化酶活力，不能还原硝酸盐。不产H₂S，V.P.实验结果为阴性。不能利用肉汤培养基生长，且不能在NaCl浓度≥1%的M-YMA平板上生长。

6.脂肪酸含量测定结果

不同属的细菌脂肪酸组成成分及含量具有较明显的差异。因而细胞脂肪酸组分及含量分析可以作为微生物种水平鉴定的一个重要性状，近些年来在微生物分类学中得到较广泛的应用。选择CCBAU 83963^T及16S rRNA基因相似性最大的8个模式菌株，即温带中慢生根瘤菌SDW018^T、锦鸡儿中慢生根瘤菌CCBAU 11299^T、天山中慢生根瘤菌CCBAU 3306^T、戈壁中慢生根瘤菌CCBAU 83330^T、刺槐中慢生根瘤菌CCNWYC 115^T、耐重金属中慢生根瘤菌LMG 24485^T、塔星木中慢生根瘤菌CCBAU 83306^T和地中海中慢生根瘤菌USDA 3392^T等进行细胞脂肪酸含量的测定。结果表明，所有供试菌株除了含有16∶0、17∶0、17∶0iso、18∶0、19∶0cyclo ω8c和不能分开的脂肪酸8（18∶1 ω7c或17∶1iso ω9c）等中慢生根瘤菌属菌株特有的脂肪酸以外，还以18∶1 ω9c、18∶1 ω7c 11-甲基、20∶2 ω6，9c和不能分开的脂肪酸3（16∶1 ω7c/16∶1 ω6c或16∶1 ω6c/16∶1 ω7c）等作为含量较高的4种脂肪酸。而代表菌株CCBAU 83963 ^T区别于其他8个中慢生模式种，其高含量的脂肪酸是19∶0cyclo ω8c（44.88%）和17∶0iso（3.62%），表明代表菌株属于中慢生根瘤菌属，但是又不同于其他的已知种，可能代表一个新种群。

7.极性脂鉴定结果

极性脂鉴定结果表明，菌株CCBAU 83963 ^T含有磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油作为其主要的极性脂组成成分，同时还含有磷脂酰-N-二甲基乙醇胺、含鸟氨酸的脂质和磷脂作为其小量的组成成分。选用茚三酮作为显色剂，并在100℃加热5min后检测，磷脂酰乙醇胺和含鸟氨酸的脂质是主要的两种氨基脂。在该菌株中没发现糖脂。

8.交叉结瘤试验结果

交叉结瘤试验结果表明，新疆鹰嘴豆根瘤菌代表菌株CCBAU 83963 ^T在实验室光照培养条件下，只能与原宿主鹰嘴豆结瘤，而不能与苜蓿、三叶草、豌豆、蚕豆、菜豆、紫云英、大豆和豇豆这8种供试豆科植物结瘤。这反映了鹰嘴豆根瘤菌高度的宿主专一性。

三、新种的描述

根据BOX指纹图谱分析、16S rRNA、atpD、recA和glnII基因及三个持家基因合并序列（atpD-recA-glnII）的系统发育分析、数值分类分析、脂肪酸种类分析、极性脂种类的测定以及DNA同源性分析的结果，该新种具备了中慢生根瘤菌属共有的特征，但是又区别于中慢生根瘤菌属内的已知种，所以，它们代表中慢生根瘤菌属的一个新种。因为这些菌株都分离自新疆的木垒县及周边，而木垒县鹰嘴豆又被国家质量监督检验检疫总局批准为“地理标志产品”加以保护，所以，将新种命名为木垒中慢生根瘤菌（Mesorhizobiummuleiense），模式菌株为CCBAU 83963^T（=HAMBI 3264^T=CGMCC 1.11022^T）。

该菌为革兰阴性，需氧，长杆状，可以运动，不产芽孢，菌体大小为（0.91～2.40）μm×（0.46～0.61）μm。该种在M-YMA平板上28℃培养10～15d后，能产生圆形、凸起、白色、不透明、直径约1～2mm的单菌落，产酸，不能在4℃、10℃和37℃下生长。该菌可以在pH6～9范围的M-YMA培养基平板上生长（最适pH为6～8），不能在pH大于等于10的条件下生长。

代表菌株CCBAU 83963 ^T可以利用D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、菊糖、葡萄糖酸钙、内消旋赤藓醇、D（+）-半乳糖、葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、L-鼠李糖、D-核糖、乙酸钠、D-山梨糖醇、蔗糖、海藻糖、D-木糖和L-脯氨酸作为唯一的碳源生长，而不能利用D-松三糖和己二酸。同时该代表菌株可以利用L-精氨酸、L-半胱氨酸、DL-α-丙氨酸、次黄嘌呤、L-异亮氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-甲硫氨酸和L-苏氨酸作为唯一的氮源生长，而不能利用L-天冬氨酸、D-谷氨酸、L（+）-谷氨酸、L-苯丙氨酸和D-苏氨酸。

CCBAU 83963 ^T可以分别在含有5μg/mL新霉素、硫酸卡那霉素、庆大霉素、氯霉素或者四环素的M-YMA平板上生长，并且能在含有300μg/mL红霉素的M-YMA平板上生长。能在含有0.1%刚果红的M-YMA平板上生长。有过氧化氢酶活力和弱的淀粉酶活力，没有氧化酶活力，不能还原硝酸盐。不产H₂S，V.P.实验结果为阴性。不能利用肉汤培养基生长，而且不能在NaCl浓度大于等于1%的M-YMA平板上生长。

代表菌株不同于已知种，18∶1 ω9c，18∶1 ω7c 11-甲基、20∶2 ω6，9c和不能分开脂肪酸3（16∶1 ω7c/16∶1 ω6c或16∶1 ω6c/16∶1 ω7c）等作为其含量较高的4种脂肪酸，且19∶0cyclo ω8c（44.88%）和17∶0iso（3.62%）含量很高，不同于已知种。

代表菌株含有磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰甘油作为其主要的极性脂组成成分，同时还含有磷脂酰-N-二甲基乙醇胺、含鸟氨酸的脂质和磷脂作为其小量的组成成分，但是不含糖脂。