种是生物分类中基本的分类单元和分类等级。种作为分类单元，指的是“物种”，而物种的概念目前还没有定论。在高等生物中，物种是能够彼此杂交繁殖的自然居群，而该居群与其他居群在生殖上是隔离的。在这里，“生殖隔离”被看作是区分物种的标准。由于原核生物缺乏严格意义的有性杂交，尽管根据能否通过转化、转导和接合等途径进行基因交换来定种，但是由于涉及基因交换机制的各种障碍，仅根据这个标准定种存在许多问题。目前还可以根据基因序列资料来分种，如把DNA杂交同源性在70%以上的菌株定为一个种。所以，在细菌分类中，当命名一个新种时，往往要用这些基因型特征进行种的界定。而在过去，微生物分类所描述的种，主要是根据各种特征，如表型特征等综合分析来划分。所以，微生物的种可以被认为具有高度特征相似性的菌株群，这个菌株群与其他类群的菌株有很明显的区别。

一、细菌种的概念及形成机制

与多数真核生物不同，细菌和古生菌主要通过二分裂繁殖，单个母细胞DNA复制，将遗传物质平均分配到2个子代细胞中。个体间DNA的交换与个体繁殖紧密伴随。在真核生物中通过减数分裂和核配进行，而原核细胞没有减数分裂和核配过程。该现象清楚地预测，无性繁殖微生物细胞间，相对于双核、有性繁殖的真核生物，基因的交换频率极低。结果，微生物生长繁殖后形成近乎相同的个体组成的菌落，来自相同的祖先个体，具有高频率的遗传适应性。

1.生物学种的概念

生物学种（biological species）的概念是具有一定形态和生理特征以及一定自然分布区域的生物类群，是彼此之间可以杂交的个体集合体。生物学种是动物、植物和微生物分类的基本单位，既是生物繁殖的单元，又是生物进化的单元。生物通过种内繁殖而世代传衍，一个物种中的个体一般不与其他物种中的个体交配，或交配后一般不能产生有生殖能力的后代。物种是生物进化过程中从量变到质变的飞跃，是自然选择的历史产物。传统的生物学种的概念，不适合细菌、古生菌，以及难以通过有性繁殖方式产生子代的一些原生动物、动物和真菌。在细菌和古生菌，生物学种的概念可修正为彼此可以发生遗传重组（遗传物质交换）的菌株群体；然而，实际情况可能比较复杂。

（1）细菌遗传物质交换的主要机制 种的典型特征是种内个体间可自由交换遗传信息。细菌可通过三种准性机制交换遗传信息：转导、接合和转化。这些机制从供体细胞向受体细胞单向引入DNA，而且引入的DNA通常为小片段的基因组。细菌的重组相对于多数植物和动物来说，很不频繁。

多数情况下，DNA通过同源重组整合进受体基因组。在同源重组中，供体DNA取代了受体细胞的同源片段。偶然情况下，细菌重组可通过异源重组导入供体DNA。异源重组也可以同源重组机制发生，但异源供体片段的侧翼必须有小段与受体同源的序列。此外，如果供体DNA包含插入序列，即使与受体没有任何同源性，也可整合进受体基因组的任何地方。基因组分析表明，典型细菌的大部分基因座位从极度趋异的分类元获得（即通过异源重组来自不同的细菌）。细菌可与DNA序列差异25%（还可能更多）的个体发生同源重组。整合需要20～30bp的近乎完美的DNA匹配。由于错配修复，整合不同的DNA序列限制同源重组的发生。在G^-和G⁺细菌，重组频率随着供体-受体序列趋异而指数级下降。

①转导：异源基因可整合在转座因子上，导入受体细胞的质粒或噬菌体。最近研究表明，包含小于1000bp的基因组小片段的同源重组，可在存在明显地理距离的情况下发生，噬菌体可能负责这样的基因转移（转导）。转导开始于病毒感染。如果病毒感染细胞（供体）的一个基因组片段被子代病毒错误包装，形成含有供体基因组片段的子代病毒，就可能发生转导现象。含有错误包装供体基因组片段的病毒粒子感染新的细胞（受体），来自供体细胞的DNA就注射入受体细胞质。供体DNA可通过同源重组或异源重组整合到受体基因组中。转导可转移的供体DNA的长度可达噬菌体基因组全长，达几百kb。由于研究的所有细菌都会被病毒感染，且错误包装供体基因组片段会导致转导的发生，在肠道沙门菌溶源化的自然菌株中概率达94%，因此，肠道细菌通过普遍性转导发生频繁基因转移，是存在一定可能性的。

②接合：是指质粒介导的遗传交换。当供体基因组DNA整合进感染性质粒，细菌间发生基因重组是可能的。进而质粒可以促进其自身向另外的细胞转移，将供体DNA导入潜在的受体细胞。质粒接合可转移比转导更大的基因组片段，可达数百至数千kb。然而，涉及大片段DNA的质粒转移，似乎没有转导那么普遍。

③转化：受体细胞转化吸收DNA则是一个主动过程。在芽孢杆菌（Bacillus），转化的发生涉及超过20种蛋白质，很多蛋白质目前没有发现其他的功能。有些细菌，如奈瑟淋球菌（Neisseria gonorrheae），一直可以处于感受态；而一些G ⁺细菌，如芽孢杆菌和链球菌（Streptococcus），必须由环境条件如饥饿诱导感受态才能出现。转化导入环境中较小的自由DNA片段（最大可达基因组的1%）至受体细胞内。估计约1%的细菌可以发生自然转化。虽然如此，理论上导入受体细胞的DNA是可观的，即基因重组事件发生非常普遍。对大肠杆菌，通过重组获得变异等位基因与通过突变获得突变等位基因的概率的比值估计为（20～50）∶1；对有些细菌由于自然转化事件的发生，使菌株特异性的基因高频交换成为可能，该比值还更高。

④基因横向转移：很多基因从不相关来源引入基因组中，不合规则地或位点特异性地通过重组掺入进来，而不是通过同源重组与紧密相关序列整合，这个过程即基因的横向转移（horizontal gene transfer，HGT），又叫基因的水平转移（lateral gene transfer，LGT）。这个概念是相对于基因垂直转移（亲代传递给子代）而提出的，它打破了亲缘关系的界限，使基因流动的可能变得更为复杂。编码中央代谢功能、完整生物合成途径、转录部分和翻译机器，甚至核糖体蛋白和核糖体RNA已表明在巨大的系统发育距离间转移。很远缘机体间的横向（或水平）基因转移比想象的更普遍。通过检测到非相关分类单元基因间的反常高度相似性，系统发育方法表明，大部分的原核基因组来自于基因转移。例如，海栖热袍菌（Thermotoga maritima）24%的基因组预测来自于古生菌品系，也许便于其侵入高温栖息地；超过20%的大肠杆菌基因组是通过基因转移最近引入的。并且一系列的研究表明，大肠杆菌（Escherichia coli）的高频转导（Hfr）菌株可以将遗传信息传递给特定的鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium）突变菌株。

在细菌基因组内，LGT是普遍的和正在进行的过程。LGT带来基因的分散分布和非典型序列特征，很明显在所有分类水平都有明确的发生基因转移的例子，即使是所有生命形式共同的基因之间。LGT具有在任何基因和所有机体间发生的能力，并非只有细菌种和其他分类群才具有。LGT被认为与进化相关，并且被引入了分子进化及宏观进化领域，被认为是推动进化的重要动力。基因水平转移是一个复杂的多步骤的过程。Jonathan将此大致分为6个步骤。首先要被转移的遗传物质在供体中进化。当达到某一点时，遗传物质通过载体（如病毒）或者直接（如接合）或者间接（如转化）地进行转移。这些遗传物质必须获取能够在受体中长期存在的形式。不同的转移和存留方式决定了不同的水平基因转移类型。被受体接受的遗传物质在受体群落中广泛传播，即使这些遗传物质的传播是符合中性法则的，但是自然选择的压力会有可能促进这一传播过程（如抗生素抗性的选择）。而这一过程对供体和受体的进化都具有影响，最终有可能会产生一个新的品系，这被称之为“改良（amelioration）”过程（图8-1）。这一过程实际上是漫长而复杂的。

图8-1 细菌之间基因的横向转移

（2）有性隔离的机制以上基因重组事件成功发生的频率并不高，受到多种限制的影响，包括生态隔离、行为隔离、DNA进入的障碍、限制性内切酶活力、供体DNA整合进受体染色体的过程和错配修复等。

①生态隔离：种群间的生态差异可在时空上分离种群，生态差异可降低细菌种群间的重组率，特别是当种群栖息于不同的微生境，即生态隔离。接合（需要细胞-细胞接触）的情况需要严格的物理接近。供体和受体的物理接近也促进转化介导的重组（转化需要的自由DNA在环境中寿命有限）。转导是对供体和受体间物理距离最不敏感的过程，因为环境中噬菌体通常稳定存在。

②行为隔离：在G ⁺细菌如芽孢杆菌和链球菌，转化需要的感受态是通过群体感应机制（quorum sensing）诱导的。在特定的生长条件下，细胞产生激素，仅在激素达到特定水平时才诱导转化所需的感受态。枯草芽孢杆菌和肺炎链球菌产生的激素具有明显的特异性。因此，在混杂细菌生活的少量菌株（甚至有些情况下相同种的其他基因型）相比主要菌株，不大可能成为感受态，这即为行为隔离。

③DNA进入的障碍：对于细菌来说，DNA可被阻止进入潜在受体内部。在G ^-转化系统，供体必须具有一段短的、分类元特异性的吸收序列，可有效进入受体细胞。在基因组中，分类元特异性吸收序列每约4kb出现一段，比想象的偶然出现的频率更高。G ⁺转化不需要吸收序列。在载体介导的重组（如转导和接合）中，供体DNA导入受体细胞受限于载体的宿主范围。大多数噬菌体可感染单一种或紧密相关种的菌株，因此，转导限于紧密相关种间的基因重组。同样，多数质粒的宿主范围较窄。然而，有些质粒的宿主谱很广，能够促进不同门间细菌的重组。不同门间细菌的重组，实际上多数通过广谱质粒介导而发生。总之，DNA进入的障碍极大降低了重组频率。

④限制性内切酶活力：限制现象对性隔离产生中等影响，主要影响转化。在枯草芽孢杆菌，仅少数菌株具有限制性酶活力，仅降低转化率2%～6%。限制现象对G ⁺菌转化的影响很有限，因为DNA进入受体细胞是单链形式，而限制性酶仅攻击双链DNA。明显降低转化率似乎是由于供体DNA整合后（因为供体-受体的异源双链中仅一条链为甲基化的）受体自身染色体的断裂而杀死很多转化子的缘故。

⑤供体DNA整合进受体染色体：如果发生整合，受体和供体DNA的一端或两端必须序列近似或相同。在芽孢杆菌、链球菌和埃希菌研究发现，随着序列的趋异性，种间重组率指数级下降。例如，在芽孢杆菌转化中，序列差异每增加5%，重组率就下降至1/10。

⑥错配修复：在大肠杆菌和肠道沙门菌（Salmonella enterica），异源双链间检测到的每个错配作为一个复制错误，激发一条链的几百个碱基对的移除。移除的链通常为供体链，因为还没有被受体的修饰系统甲基化。错配修复负责肠道细菌种间所有的重组率降低。在G ⁺转化中，错配修复对性隔离的影响中等。芽孢杆菌种间16%、链球菌种间34%性隔离（降低重组）归于错配修复。(www.daowen.com)

2.生态种的概念

生态种（ecological species）是占据不同生态节点的菌株集合体。生态型（ecotypes）是具有一定程度生态独特性的菌株集合（如在新碳源上生长或不生长，或病原菌增加或降低病症等）。与同一种的其他生态型相比，一种生态型仅有少量基因成分（或基因表达）的差异。周期性选择（periodic selection）促进新生态型的不断产生。自然选择消除了一个生态型内的遗传差异至零。

例如，大肠杆菌的一个菌株在葡萄糖限制的恒化器中长时间培养（800代）。该恒化器中所有细胞仅竞争利用葡萄糖，其他成分都过量。培养物周期性地转接到新鲜恒化器，确保恒化器的玻璃壁不增加生态节点。大肠杆菌同化利用葡萄糖，分泌乙酸和少量甘油；这些物质可进一步同化利用。这样，开始的一个菌株经过较长时间的转接培养，有可能进化至至少3个菌株共存：一个菌株利用葡萄糖的能力较强，但不能进一步同化利用乙酸和甘油；另外2个菌株保持可同化利用葡萄糖的能力，但可进一步同化利用乙酸或甘油。

3.表型种的概念

传统上，表型种（phenotypic species）定义为位于特定地理区域的形态相似的生物体集合，与其他机体类群形态明显不同。数字分类已经清楚地表明，可将细菌菌株归类为独特的表型类群，可发现新种，可将未知菌株归为已经描述的种。表型种的概念存在一定的问题：首先必须获得细菌的纯培养物，然后再通过表型和基因型的比较分析进行鉴定，然而自然界存在的大多数微生物难以人工分离培养；其次，一些微生物生理生化特征非常接近，但其遗传差异较大，如大肠杆菌E.coli K12和E.coli O157∶H7菌株；第三，遗传相似的个体的代谢差异也可能很大。

在现代分类鉴定中，微生物的分子特征在其分类鉴定中占据非常重要的地位。表型种通常限定为在温和给定条件下DNA杂交后超过70%复性率，并且该复性DNA的热稳定性在4℃以内（DNA序列的同源性较高）的菌株集合。要注意的是，DNA-DNA杂交（DDH）法不是直接测定序列的一致性，而是测定杂交DNA分子的复性效率。因此，70%DDH不等同于70%序列一致性。在基因组水平，超过95% ANI（average nucleotide identity，核苷酸平均一致性）的基因组，按照70% DDH标准，应属于相同种。采用95%ANI标准划分不同的种，则一个种可以包括基因成分差异超过35%的菌株（如果排除移动因子，则该数据为20%）。按照70% DDH标准，相当于95%ANI，同一个种的细菌基因组的基因成分（或基因表达）差异很大。

除了基因成分，基因表达对个体的表型或生态潜能发挥着重要作用。个体间共享基因的不同表达调节或表达水平可能构成另外水平的分化。相对于基因成分的差异，发育过程中的不同基因表达对物种间的形态差异的贡献更大。

基于形态特征、生理生化特征和遗传学性状等对微生物物种形成的不同影响，按照《伯杰细菌系统学手册》，细菌需要多相分类鉴定，即必须测定细菌多种分类性状，包括形态学、生理和生化实验、生长底物、营养来源、固氮性能、pH范围、酶学实验、脂肪酸分析、G+C含量、紧密相关个体间的DNA-DNA杂交和系统发育分析等，然后才能命名一个表型种。

4.系统发育种和基因组种的概念

（1）系统发育种 系统发育种（phylogenetic species）为具有共同祖先和进化后代的生物体集合。一般认为一个物种代表的是一个独立进化中的谱系枝（lineage segment），是进化长河中一个谱系（lineage）的某个分支或片段，而非该谱系的全部。区分系统发育种的主要方法就是比较不同菌株的分子序列。实际上，分子细菌分类学的难点在于以下两点：第一，两个个体需要达到怎么样的相关性才属于同一个种群；第二，不同“种”之间存在着基因的横向转移。而构建系统进化树选择的小分子如16S rRNA基因等，一般在属以上水平有意义，不能区分属以下水平的菌株。

（2）基因组种基因组种（genomic species）是基于DNA-DNA杂交的相关性和热变性、16S rRNA基因序列相似性等界定的。标准是：杂交值大于70%同源性、热稳定性小于5℃差异，同时16S rRNA基因序列相似性通常大于98%，即为一个基因组种；相反，16S rRNA序列一致性小于98%和DNA-DNA杂交的同源性小于70%的个体可区分为不同的种。该定义适用于多数细菌，对发现和定义新细菌种有用。

对于难培养或者不可培养的细菌，同样可以采用16S rRNA基因序列高通量测序的办法进行分析，但是前提是假设无16S rRNA基因的横向基因转移，同时还需要假定16S rRNA基因的不相似性可以反映整个基因组。

（3）基因组-系统发育种基因组-系统发育种（genomic-phylogenetic species）是一个方法学的概念，严重依赖于生物大分子序列（如蛋白质、RNA和DNA）的比对。使用该概念有两个目的：第一，基因组-系统发育种为细菌分类学提供了一个概念上和操作上的框架；第二，基因组-系统发育种可代替DNA杂交使用，简便了描述新种的鉴定操作。

二、细菌的物种形成

地球上究竟存在多少种细菌？随着研究技术的进步，人们认识到环境中可培养细菌的数量所占环境中细菌总数的比例不及0.1%。研究发现，1g森林土壤中至少存在10000种细菌。

物种形成（speciation）是形成新物种的过程。细菌世界存在大量细菌种，可解释为细菌具有物种形成的巨大潜力。相对于高等动植物，细菌具有更多的物种形成的机会。主要有以下原因：首先，细菌物种形成仅需要生态趋异；其次，细菌生长繁殖迅速，在外界生物和非生物条件适宜时，短时间可以产生巨大的种群值，在细菌世界更容易发生稀少的突变和重组事件；第三，细菌可以与很多相近分类元的细菌发生基因交换，甚至与远缘生物也可通过HGT发生遗传物质的交换，在一些情况下，受体可通过同源重组获得其他物种的适应性等位基因，从而可获得新适应性，使细菌比真核生物更加容易开拓新生态节点；第四，遗传物质的异源转移极大促进了细菌逃离初期生态型，以及与其以前种群的竞争，获得了新的完整代谢功能，初期生态型可以利用其亲本生态型不能利用的资源；最后，细菌遗传交换的多样性可帮助初期生态型脱离亲本生态型，通过遗传交换，初期生态型将从其他生态型获得适应性突变，新的生态型将因而失去其劣势。

细菌具有极大种群的原因有两个：第一是低灭绝率。细菌个体小，数量多；当条件恶劣时，细菌可休眠。细菌可生存的环境比后生生物（具有片状结构的原植体植物和多细胞动物）要宽得多。细菌能忍受更粗犷的条件。所有这些都可导致低灭绝率。如果细菌能避免群体灭绝，那么它们已经经历了30亿年的持续物种扩张了。第二，高物种形成速率。细菌物种形成更加容易和平常。如果占据不同的生态节点，两个菌株就是不同的生态学种；如果占有相同的生态节点，则为一个生态学种。该定义暗示，相同生态学种的不同群体可轻易相互替换，产生多种不同的生态型菌株，但不同种的种群不能。每个生态学种具有特定的资源利用优势，结果可延长在特定节点的存在时间。如果该时间足够长，则一个种可能变得足够不同和独特，直至可以采用DNA标准定义为新的物种。细菌存在大量物种的原因似乎更多是由于更高的物种形成的速率，而不是不平常的低灭绝率。

最实用的细菌种的概念为生物学种和系统发育种的概念，功能上是基于这些过程的不同权重。在细菌物种形成的时间长河中，发生了有限但较多的遗传交换。按照“时间片段化物种形成”模型，细菌的遗传隔离在物种形成过程中，不同时间建立起来不同的染色体区域，因为细菌重组涉及仅少量的DNA片段而不是完整基因组的偶尔转移。结果，细菌物种形成自从获得了第一个节点特异性基因，可能持续了数百万年，在该过程中同源重组不断地发生着。种间重组为多种因素所限制，包括生态隔离、行为隔离、DNA进入障碍、限制性内切酶活力、趋异DNA序列整合抗性、错配修复逆转重组和重组片段的功能不亲和性等。自然选择可调节性隔离的水平，增加有利于受体的基因转移，而减少有害基因的转移。自然选择明显地充当减少细菌种间性隔离的角色。种间重组可能也通过从趋异种引入新的基因位点而刺激新物种形成，允许其侵入新的生态节点。