传统的微生物分子生物学方法是基于微生物培养技术形成的，为微生物分类、生理、遗传等微生物学各个领域的发展奠定了基础。但是，迄今为止，自然界中绝大多数的微生物不能被现有的传统微生物培养技术分离出来。目前的研究结果表明，海洋中可培养的微生物仅占其中总微生物数量的0.001%～0.1%，淡水中约为0.25%，土壤中约为0.3%。
自然界中存在许多制约因素影响微生物的分离培养。①现有培养条件不能再现原生态环境条件，如深海高压环境、高温火山口等极端环境。此外，人工培养环境通常限定在营养基质简单、通气、温度、pH等恒定条件，许多微生物失去了在原来环境中自由生长的必要条件，因此无法进行分离培养。②人工培养环境忽视或破坏了原生环境中的微生物生态系统。自然环境中微生物种群间存在拮抗、寄生、协同、互养共栖、共代谢等复杂的种间关系。环境中共代谢对于建立两个种群间的偏利共生关系起着很重要的作用。此外，微生物群落中存在群体感应（quorum sensing），微生物可以通过信息交流判断群体密度大小和生长环境中出现的变化，启动相应的基因做出统一协调的应答。但是在进行常规分离培养时，微生物从天然环境转至人为设置的培养环境，原生环境的重要生态关系被破坏，菌群中的生物信息交流体系发生了根本性变化，群体效应通常会被忽视。实践表明，一些最初能在人工培养基中以混合培养的方式生存的种类，在分别转接到同样的培养基中，因为缺乏独立生长的能力而不能存活。③过高的人工培养基浓度或微生物氧化环境的能力。传统的微生物培养为了达到微生物生长率和产物产量最大化的目的，通常采用营养丰富的培养基，导致分离到的微生物大多为生长迅速且偏爱丰富营养的微生物。然而，自然界中大多数为低营养甚至寡营养生活方式的微生物。当微生物从自然环境转移至营养丰富的人工培养基中，低营养甚至寡营养生活方式的微生物会因为高浓度营养基质的抑制而停止生长。在人工培养环境的好氧条件下，快速生长的微生物产生过氧化物、自由基和超氧化物，使其他的微生物受到毒害抑制。从根本上讲，由于客观条件的限制，目前不可能人为全面地还原其真实的生长环境。此外人们对微生物生长环境的复杂性、微生物生长条件及其规律性的了解有所限制，是造成微生物不可培养或难培养的原因。
针对上述缺陷，科研工作者在以往传统微生物培养方法的基础上，研发出一系列改善微生物培养的新方法。改良的微生物培养方法大致分为两类：第一类是对传统培养基组成和培养方式进行改良，包括添加微生物相互作用的信号分子，供应新型的电子供体和受体，降低营养基质浓度，改善微生物培养条件，促进低营养及寡营养微生物种类的分离培养等；第二类是设计原生境的高通量微生物培养技术和装置，如应用于海洋和陆生环境的扩散盒技术、土壤基质膜技术以及高通量微生物分离芯片等。
1.稀释培养法（dilution culture）
自然环境中的微生物大多处于低营养或寡营养的状态。环境中占主体的寡营养微生物在人工培养时，受到少数优势生长微生物的竞争而不能正常生长。针对这种缺陷，研究者提出把环境微生物稀释至痕量，则寡营养微生物可以不受到少数优势微生物竞争作用的干扰，被培养的可能性会大大提高。目前，稀释培养法已经广泛应用于海洋微生物生态学、淡水湖泊微生物生态学、土壤微生物生态学以及动物肠胃微生物生态学等多个研究领域，为发现微生物新物种提供了良好的技术支撑。
2.高通量培养技术（high-throughput cultivation）
为提高分离效率，在稀释培养法的基础上提出了高通量培养技术：将样品浓度稀释至10 -3个/mL后，采用48孔细胞培养板结合流式细胞仪检测分离培养微生物。利用高通量培养技术可以分离培养14%的海洋微生物，远高于传统分离培养技术中微生物的数量，并发现了多种未培养的海洋微生物。此后高通量测序技术通过与分子生物学中的荧光原位杂交技术结合，不仅提高了微生物的可培养性，还可在短时间内监测大量的培养物，大大提高了工作效率。
3.模拟自然环境的培养技术
模拟自然环境的培养技术包括扩增盒培养技术（diffusion growth chamber）和细胞微囊包埋技术（microencapsulation）两种。
扩增盒培养技术是利用培养仪器——扩增盒将环境微生物在原位条件下进行富集生长，最终得到纯培养的微生物的方法。以海洋微生物原位富集为例，扩增盒由一个环状的不锈钢垫圈和两侧胶连的孔径为0.03μm的滤膜组成，滤膜只允许培养环境中的化学物质流通，而细胞不能通过；扩增盒内加入稀释底泥与琼脂的混合物，封闭后置于天然海洋底物上，并不断注入新鲜海水循环流动；培养一周后获得40%的接种微生物，并能够分离得到新的微生物物种。此后，这种方法应用于研究土壤和水体、污泥环境中的难培养微生物。扩增盒技术初次培养获得的微小菌落多数为混合培养，通常需要再次分离才能获得纯培养菌落。该方法可以模拟自然环境，不同细胞间经过互喂，形成独立的菌落。
细胞微囊包埋技术是一种将单细胞包埋培养与流式细胞仪检测结合为一体的高通量分离培养技术。双包埋培养技术将微生物包装在琼脂球内，外面再用一层多羰基高分子膜包裹。将这种双层包裹的小球放置于珊瑚表面黏液进行培养，获得新的微生物。此后，这一技术进一步发展，设计了一种高通量的微生物分离芯片，每个扩散孔只含有一个微生物细胞。采用这种芯片装置，分离到大量的海水和土壤微生物，其中有30%左右的新物种。细胞微囊包埋法在接近于天然生长的环境中有效提高了微生物的可培养性。但是该方法建立的时间较短，还存在一些如包埋基质机械强度低、渗透性差、微生物热敏感等技术难题，并且成本高，仍旧需要进一步改进。
4.改良微生物培养基组成和培养条件
微生物的多样性表现出生理代谢的多样性及复杂性。不同的微生物生长代谢类型不同，对反应的底物要求也存在差异。因此根据微生物的某些特性，在传统培养方法的基础上，选择性地添加微生物生长所必需的营养成分，从而使原先无法培养的微生物变为可培养的。目前已经报道的改良方法包括以下几种。①改良条件包括非传统的碳源、电子供体或电子受体：采用这种方式改善难培养微生物要对目的微生物的生理特性具备一定的了解。②根据微生物自身特性的培养方法：一些微生物具有独特的代谢途径，可以将其以纯培养的方式分离出来。③添加信号分子或类似物调节促进微生物生长：自然环境中微生物群体之间需要有信息传递维系调节生长代谢，因此进行人工培养时可以向培养系统中添加有益于细胞间沟通的信号分子，有利于改善微生物的培养状态。④添加细菌实施仿生原生境共培养：根据自然环境中细菌依靠共生关系维系生长的原理，设计双层培养基。首先在平板上倒培养基，涂布已知细菌菌液；接着再倒一层培养基，涂布环境样品稀释液，可以提高分离微生物量。此方法能够模拟原生态菌群生长关系，有益于促进同类甚至不同类细菌的生长代谢。⑤添加具有解毒功效的化合物或酶抑制剂：环境中某些优势微生物种类在生长过程中会产生过氧化物及其他有毒物质，为了减少这种毒性作用，可以在培养基中添加具有解毒功效的化合物或酶制剂。
二、微生物生态学的分子生物学方法
许多分子生物学方法和理论逐渐被应用于微生物生态学研究中，为研究难培养微生物和不可培养微生物提供了可靠的技术手段。分子生物学和微生物生态学的有效结合，弥补了传统微生物生态学的不足，使人们可以避免纯培养过程而直接探讨自然界微生物种群结构与环境的关系，在微生物多样性、微生物种群动力学、重要基因定位、表达调控等方面取得了进展，极大地推动了微生物分子生态学的发展。分子生物学技术的引入，使传统微生物生态学的研究领域由自然界中可培养微生物种群扩展至包括可培养、不可培养、难培养微生物在内的所有微生物，由微生物细胞水平的生态学扩展至各种生态学现象的分子机制研究水平，提出了微生物分子进化和分子适应等全新概念，使微生物生态学理论研究更接近于自然本质。
1.基于核糖体RNA基因的微生物生态学研究方法
在微生物分子生物学领域，采用核糖体RNA基因（ribosomal RNA gene，rRNA基因）作为标志物，进行微生物鉴定以及系统分类学研究。rRNA是目前应用最广泛的分子标记，在功能上高度保守，存在于除病毒以外的所有生物体中，其序列上的不同位置具有不同的变异速率，通过可变区域序列的对比，进行微生物系统进化分析或是对特定环境微生物进行群落结构分析。
（1）rRNA基因的特点
①原核生物的rRNA基因：原核生物的rRNA包括5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA。5S rRNA基因序列较短（120bp左右），包含的遗传信息不具有代表性；23S rRNA基因长度约2900bp，序列过长，对其分析存在一定难度；16S rRNA基因长度约1500bp，在分子生物学中应用最为广泛。
原核生物的16S rRNA基因分子大小适中，种类少，含量大（占细菌RNA总量的80%），在生物进化过程中的变化非常缓慢，在结构与功能上具有高度保守性，因此用来标记生物的进化距离和亲缘关系。通过对16S rRNA基因的序列进行分析，确定了9个可变区的位置和长度，不同的可变区适合不同菌群的鉴定分析（图7-1）。其中V3区可以分开大多数细菌，V2、V6、V5、V7、V9由于序列变异程度等原因不适合群落分析和细菌鉴定。
图7-1 原核生物16S rRNA基因可变区V1～V9的位置分布
16S rRNA基因作为原核生物分子生物学研究中的重要标记基因，具有以下优点。（a）多拷贝，提高检测的灵敏性：细菌中一般含有5～10个16S rRNA基因的拷贝，易获得，提高检测敏感性。（b）序列信息量大：16S rRNA基因由保守区和可变区组成，保守区存在于所有细菌中，序列结构差别不显著；可变区在不同细菌中存在不同程度的差异，具有种属特异性。可变区和保守区交错排列，因此可以根据保守区设计细菌通用引物扩增可变区，根据可变区研究细菌种间差异。（c）序列长度适中：基因长度约为1500bp，包含50个左右的功能域，遗传信息具有代表性。
②真核微生物的rRNA基因：真核微生物存在更复杂的rRNA基因，包括5S rRNA基因、5.8S rRNA基因、18S rRNA基因和28S rRNA基因，其中18S rRNA基因、5.8S rRNA基因和28S rRNA基因组成一个转录单元。与原核微生物相比，真核微生物进化时间较短，因此相近物种间的rRNA基因序列内部缺少相应的变化。真菌rRNA基因序列中不同区域的进化速率存在显著差异。真菌18S rRNA基因和28S rRNA基因进化速率较慢，保守性高，因此一般作为属水平以上的生物群体间的系统分析。但是28S rRNA基因的D1/D2区是目前酵母菌分类鉴定中常用的分子标识之一，这些序列在酵母菌种内和种间具有足够的差异性。
与编码rRNA的基因簇相比，非编码的转录间隔区（internal transcribed space，ITS）由于进化速度迅速且具多态性，因此真菌种间差异性更加明显。真菌全长ITS序列包含其两端的18S rRNA基因和28S rRNA基因的部分序列和中间的ITS1区，5.8S rRNA基因ITS2区的完整序列，拥有相对丰富的微生物信息。同时由于ITS序列两端的18S rRNA基因和28S rRNA基因序列高度保守，便于进行引物设计（图7-2）。基于rRNA基因-ITS长度多态性和序列多态性分析，从核酸序列获得足够的遗传信息研究真核微生物亲缘关系与分类情况，已经广泛应用于真菌的属种间及种内组群水平的系统学研究。
图7-2 真核微生物核糖体rDNA重复单位结构
（2）rRNA基因序列分析技术的基本原理基于rRNA基因的分子生物学分析技术就是从环境样品提取微生物总核酸，获得rRNA基因可变区片段或全长rRNA基因，通过克隆、酶切、高通量测序、探针杂交等分子生物学技术，获得基因序列信息，并与rRNA基因数据库序列信息进行比较，确定其在系统发育中的地位，对微生物进行分类分析。
①环境样品微生物总核酸提取：不同环境样品中，提取微生物核酸的难易程度不同，因此提取方法存在一些差异。为了满足后续的分子生物学操作，提取的微生物核酸需要满足以下要求：微生物基因组提取过程中尽量避免断裂，保持完整；微生物核酸纯度高，应去除小分子和有机质等污染；尽量破碎微生物细胞，提高核酸回收率，有利于后续分子生物学操作。
②研究rRNA基因的分子生物学方法：研究16S rRNA基因的常用分子生物学方法有多种，主要有变性梯度凝胶电泳法、末端限制性长度多态性、DNA/RNA印记杂交（southern blot/northern blot）、基因芯片技术（gene chip）和高通量测序技术等。
③rRNA基因序列分析方法：通过对获得的rRNA基因进行序列分析以及同源性比较，可以绘制系统发育树，计算不同属、种微生物的遗传进化距离，判断菌种间的遗传关系。采用的系统发育分析方法包括距离矩阵法（distance matrix methods）、聚类分析法（cluster analysis）等，目前使用的序列对比软件有Mega、MicroSeq、Phylip、Mothur等。这些软件使用的计算方法不同，因此结果可能会存在稍许差异。检索rRNA基因数据的网站有NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）、RDP（http://rdp.cme.msu.edu/misc/about.jsp）、EMBL（http://www.ebi.ac.uk/embl）等。
2.基于PCR技术的基因图谱技术
在分子生物学技术发展的初期，主要是通过直接分析某些低分子质量rRNA基因的电泳图谱，研究微生物群落结构的多样性。但是，低分子质量rRNA基因相对较小，携带的遗传信息较少，因而揭示微生物多样性的能力有限。因此，目前主要针对携带信息量较多的16S rRNA基因或18S rRNA基因进行扩增，甚至针对某些微生物种类特有的功能基因进行PCR扩增，进而进行基因图谱分析，来研究微生物群落结构的多样性。目前，广泛应用于微生物生态学中的基因指纹图谱技术主要包括克隆文库方法（clone library）、变性梯度凝胶电泳法（DGGE）、限制性片段长度多态性分析（RFLP）、单链构象多态性（signal stranded conformation polymorphism，SSCP）、随机扩增多态性DNA（randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）、高通量测序技术等。
（1）克隆文库法 克隆文库法使得分析不可培养微生物成为可能，是微生物生态学常用的研究方法之一。构建文库的基本过程包括以下几步：以环境样品中的总DNA或cDNA为模板，通过特异引物扩增目的基因；将PCR扩增产物插入合适的克隆载体，转入载体细胞，建立克隆文库；挑选培养基上的单克隆，使用载体引物或PCR引物对序列进行测序。克隆文库法可以针对不可培养微生物进行分析鉴定，提高了对微生物群落结构的认识。
（2）变性梯度凝胶电泳 在1992年第6次微生物生态学会议上，提出了DGGE技术在微生物生态学研究中应用的可能性；1993年Applied and Environmental Microbiology杂志上发表了DGGE应用于微生物生态学研究的论文。此后，DGGE技术广泛应用于土壤、水体、食品以及动物肠道等环境微生物群体的研究，研究微生物群落的复杂性以及行为，推动了微生物生态学的发展。DGGE技术具有快速、可靠、可重复、易操作等特点。基于rRNA基因的DGGE能够直接显示环境中的优势微生物，可以同时对多个样品进行分析，研究微生物群落的时空变化；基于功能基因的DGGE技术能够用来鉴别密切相关但是生态上不同的微生物种群。
①DGGE的基本原理：在含有浓度递增的变性剂（尿素和甲酰胺混合物）的聚丙烯凝胶电泳中，可以将长度相同、碱基序列不同的双链DNA分离，使凝胶图谱出现多态性。采用带有GC夹子（G和C碱基集中的序列）的引物PCR扩增目的基因，PCR产物在变性剂浓度从正极至负极递增的电泳胶上泳动，双链DNA间的氢键由于变性剂浓度的递增而发生断裂，解链成单链DNA。然而由于引物GC堆积部分氢键难以断裂，仍旧保持双链结构，形成3方延伸形状。这种形态的DNA分子迁移率极大降低，具有同样碱基序列的DNA集中在一处形成条带。序列不同的DNA由于氢键数量和排列的不同，在不同浓度的变性剂下解链，因此在凝胶的不同位置形成条带，从而将长度相同但是序列不同的DNA片段分离。
DGGE技术克服了传统微生物培养技术的缺陷，可用于研究不可培养微生物以及难培养微生物，产生的微生物指纹图谱可以直观反映微生物群落结构的多样性，并且可以检测DNA序列单碱基的变化，经常用于分析不同环境样品之间的微生物多样性差异。然而，DGGE技术也存在着一定的缺陷：DGGE技术只能检测500bp以下的DNA序列，过长的条带会降低检测灵敏度；DGGE指纹图谱仅能够初步反映微生物群落多样性的信息，但是不能够进行微生物分类以及微生物群落结构组成的分析，需要结合测序等其他分子生物学手段进行研究。
②DGGE基本操作过程：DGGE有垂直电泳和水平电泳两种电泳方式。垂直电泳变性剂浓度梯度与电泳方向垂直，适合分析单个样品的解链性质；水平电泳变性剂浓度梯度自上而下呈线性增加，多用于检测多个样品的DNA多态性，可以检测出单个碱基的基因突变。DGGE技术有两个主要特点：（a）引物末端需要添加40～50bp的GC发夹，解链过程中有利于检测解链区单个碱基的变化；（b）目标序列片段大小100～500bp，过长的片段会导致检测灵敏度降低。
DGGE的基本操作过程如图7-3所示。（a）制备DGGE凝胶：聚丙烯酰胺浓度一般为6%～12%，变性剂梯度根据目标基因序列进行调整，一般在15%～60%范围内。DGGE制胶是非常关键的步骤，制胶过程中应避免产生气泡，并根据实际情况选择胶的梯度范围。（b）电泳：电泳时间一般为3～5h。加样之前，将温度预设至66℃，待温度达到之后关闭电源，立即进样。加样后打开电源，设置合适的跑胶时间。（c）染色：染色剂一般使用毒性较小、染色效率较高的SYBR Green等，染色效率比溴化乙啶（EB）高出100倍。将染色后的胶放入紫外凝胶成像仪中，用302nm的紫外线进行凝胶成像，观察DGGE的指纹图谱。（d）条带回收：对于DGGE指纹图谱中的特征性条带，若要确定其代表的微生物种类，需要将条带从凝胶上切下并回收，结合克隆、测序等其他的分子生物学技术进行研究。
（3）限制性片段长度多态性分析 1997年，末端限制性片段长度多样性（Terminal restriction fragment length polymorphisms，T-RFLP）技术首次应用于微生物群落结构分析，研究不同环境微生物群落的多样性。目前，T-RFLP技术已经广泛应用于各种环境微生物生态学研究，对于分析复杂群落结构具有广阔的应用前景。
图7-3 DGGE基本操作过程
①T-RFLP技术的基本原理：标记PCR引物的5′末端，使扩增产物带有荧光标记；采用识别特异性序列的限制性内切酶消化PCR产物，结合末端带有标记的特异性酶切片段的序列分析，获得荧光标记片段图谱；不同长度的酶切片段代表不同的微生物类型，图谱中波峰的多少表明群落复杂程度，峰高或峰面积在一定程度上代表该类型微生物的丰度（图7-4）。
图7-4 T-RFLP的技术原理
T-RFLP技术用于微生物群落分析具有以下优点：（a）能够迅速产生大量精确且可以重复的数据，研究微生物群落结构，并且可以同时分析大量样本，适合多个样品之间的比较；（b）可以使用软件对数据进行处理，进行标准化的统计分析；（c）将末端限制性片段（terminal-restriction fragments，TRFs）长度信息与已有数据库进行比对，可以得出微生物分类信息。
但是，T-RFLP技术也存在一些缺陷：（a）无法产生像DGGE图谱一样直观的DNA图谱，直接观察微生物群落的动态变化；（b）酶切得到的是TRFs的长度信息，片段较短，在数据库中匹配不够精确，无法对其进行准确鉴定；（c）TRF数据库，尤其是功能基因库不够完善，酶切产物可能找不到匹配对象。
②T-RFLP技术的基本操作过程
a.引物的选择：理想情况下，引物应该特定于相应的目标微生物群，同时需要足够通用便于扩增相关的微生物种群。可以通过一些基于数据库的工具比较不同引物的特异性和敏感性，如微生物群落分析网站（http://mica.ibest.ui.daho.edu/）中的引物优化工具和核糖体数据库（http://rdp.cme.msu.edu/）中的探针匹配工具。进行PCR扩增的引物5′端需要引入荧光标记信号进行检测。因为不同的微生物可由一个特定的引物-酶组合产生相同的末端限制性长度片段，如果只使用一个荧光标记引物进行检测，可能会低估微生物多样性。通常可以采取使用两个或两个以上标记引物的方式解决这一问题。
b.限制性内切酶的选择：通常情况下，识别4个碱基的限制性内切酶具有较高的识别频率，在T-RFLP技术中经常使用。不同细菌使用一个特定的引物-酶组合会产生相同的TRFs，因此使用一个以上的限制性内切酶可以提高细菌种群的分辨率。限制性内切酶对不同序列的消化能力可以通过生物信息学工具进行评价，例如，T-RFLP分析程序TAP（http://rdp8.cme.msu.edu/html/TAP-trflp.html）、针对16S rRNA基因的MiCA（http://mica.ibest.uidaho.edu）、针对功能基因的ARB实现工具TRF-CUT（http://www.mpi-marburg.mpg.de/downloads/）。
c.TRFLP图谱数据分析：样品中荧光标记TRFs的长度与丰度差别可通过毛细管或聚丙烯酰胺电泳来区分。一般来说，毛细管电泳比聚丙烯酰胺凝胶电泳精确且重现性更好，能够把片段长度误差控制在1bp之内。带有荧光标记的条带通过收集软件自动转化成为数字化的峰值图谱。TRFs的实际大小利用GeneScan和GeneMapper等软件通过插值算法估计，丰度通过荧光强度确定并表征为峰高或峰面积。指纹图谱的比较结果反映的是微生物群落之间的相似关系，一般采用UPGMA聚类方法比较不同群落形成的图谱相似性及距离。当采用不同的限制性内切酶进行酶切时，形成不同的峰值图谱，相应得到几套不同的TRFs长度和波峰数据。对于同一微生物群落采用的引物-酶组合越多，分析的准确性越高。
（4）单链构象多态性 1989年，日本学者Orita M发明了SSCP方法。利用单链构象多态性，根据不同构象DNA单链在非变性聚丙烯凝胶电泳时迁移率的差异，研究DNA分子上的基因突变；之后，Orita将SSCP技术与PCR结合，增加了分析的灵敏性；1992年，日本学者Hashino进一步改进了此种方法，利用敏感的银染色法对电泳凝胶进行染色，增强了安全性；1996年，SSCP技术开始应用于微生物群落结构组成分析。目前，SSCP技术在微生物生态学研究中有一定的应用。
①SSCP技术的基本原理：在非变性聚丙烯酰胺凝胶中，不同序列的单链DNA通过分子内碱基互补配对形成不同的空间结构，但是分子在电泳中泳动，会受到凝胶不同的分子筛作用力，导致电泳速度不同，最终使这些长度相近而碱基序列不同的DNA分子分开，凝胶经染色后可以获得SSCP图谱。SSCP技术应用于微生物生态学研究具有以下优势：（a）使用的仪器简单，操作方便，有利于普及；（b）与DGGE、T-RFLP等DNA指纹图谱技术相比，对引物没有特殊的要求，不需要进行带GC发卡的引物设计或者荧光标记等处理；（c）SSCP图谱易于分析，通过特异性探针与SSCP图谱进行杂交，显示目标微生物的群落演替规律。SSCP技术在微生物群落分析过程中还存在一些不足：（a）电泳过程中同源或异源互补序列局部退火，导致一条序列在图谱上出现多条条带的现象发生。这些条带不稳定，对温度的变化敏感，导致结果重复性差。（b）环境微生物群落结构复杂，代表不同分类单元的条带分离不彻底，导致一条条带中包含多个操作分类单元。无法检测到不影响三维构象的部分碱基序列替换，有一定的灵敏性限制。（c）适于分析的片段长度较短（＜300bp），不能精确提供序列的系统发育信息。
②SSCP技术的操作过程
a.引物的选择：核糖体rRNA是研究环境微生物群落结构的理想靶基因，通常利用保守区设计引物以便扩增可变区基因。不同可变区产生的SSCP图谱条带存在显著差异。例如，Schmalenberger以纯培养微生物为研究对象，设计引物分别扩增16S rRNA基因的V2～V3区和V6～V8区，分别产生2.2条和1.7条条带。引物的选择原则是既能涵盖环境中的全部微生物，又能够降低SSCP图谱的复杂性，便于后期实验操作。
b.去除反义链：环境微生物群落结构复杂，并且同源或异源链之间存在相互作用，产生大量非特异性条带。因此，为降低SSCP图谱的复杂性，去除双链DNA中的一条链，产生单链SSCP图谱，减少SSCP图谱上的一半条带，可以给后续分析提供方便。目前，去除反义链的方法包括如下两种：（a）反义链引物5′端磷酸化，PCR扩增后，利用λ-核酸外切酶水解（lambda exonuclease）被标记的反义链；（b）反义链引物5′端生物素标记，PCR扩增后，利用卵蛋白（avidin）或链霉亲和素（streptavidin）与生物素特异性结合，钓取带有生物素标记的反义链。
c.获取SSCP图谱：为提高SSCP的灵敏度以及长片段分离能力，凝胶中一般使用49∶1的丙烯酰胺∶双丙烯酰胺，5%～10%甘油；PCR样品的上样量根据微生物群落结构的复杂程度决定，越复杂则样本量要求越高；为提高灵敏性，一般使用银染法进行凝胶染色，可以检测搭配1pg的双链DNA。
d.分析SSCP图谱：SSCP图谱无法反映微生物的分类信息，因此需要将感兴趣的目标条带从凝胶中切除，纯化目标条带；以回收产物为模板，经过相同的引物进行PCR扩增，所得产物再次进行SSCP验证后，进行克隆、测序以及其他系统发育分析。
（5）随机扩增多态性DNA 1990年，美国科学家Williams领导的研究小组和Welsh领导的研究小组几乎同时发展了一项新的分子生物标记技术，称为随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD），对于遗传多样性检测、DNA图谱构建等具有重要意义，在微生物研究领域多用于基因分型。
①RAPD技术的基本原理：RAPD技术是以PCR技术为基础，以任意序列的寡核苷酸为引物（一般为10个碱基）扩增目的基因组。模板DNA经高温（92～94℃）变性解链后，在较低温度下（一般低于40℃）退火，单链多个位点能够与引物互补形成双链结构。若两个与引物互补的位点间在可扩增范围（400～2000bp），而且分别位于互补的两条单链上，并且与引物3′-端相对，则可以通过PCR得到扩增产物。RAPD所使用的一系列随机引物序列各不相同，但对于任意特定的引物都有DNA序列的特定结合位点，如果这些区域内基因组DNA发生插入、缺失或碱基突变，则导致产生的PCR产物发生相应的变化（PCR产物增加、减少或分子质量改变）。一个引物检测到的DNA多态性较少，但是足够多的引物则可以检测到几乎整个基因组。
与传统PCR技术以及DNA指纹图谱技术相比，RAPD技术具有以下优势：（a）无需基因信息。这是RAPD技术最显著的优点。无需得到目的基因的任何序列信息，使用任意序列的引物扩增整个基因组，提高了效率。（b）应用范围广。引物没有种属特异性，可以在不同种属间进行比较。（c）灵敏度高。可以检测序列中单个碱基的变化。（d）检出率高。退火温度较低，能够使引物与模板稳定结合，同时允许适当的非特异性结合，使引物与基因组DNA结合的随机性增加，提高了RAPD的检出率。（e）简便、快速。样本量要求较低，无需其他DNA指纹图谱的大量准备性工作，可利用一套随机引物得到大量的分子标记，可借助于计算机进行分析，易于程序化和标准化。RAPD也存在一定的缺陷性：由于引物短、复性温度低等原因，会导致特异性降低，反应体系对许多因素变化敏感等。这些原因导致RAPD的重复性和可靠性较差。
②RAPD技术的基本操作过程：RAPD技术的基本操作过程一般包括环境微生物基因组DNA提取、随机引物合成、PCR扩增、随机引物筛选、电泳检测和数据分析等。
a.引物合成：引物长度一般为10个碱基左右，引物序列随机性是设计引物的基本方法。同时设计引物应该遵循以下原则：引物G+C含量要高于60%，强信号条带明显增加，对RAPD形成有较好的作用；引物3′端的最后4个核苷酸碱基中G+C含量高对于RAPD扩增有利。
b.PCR扩增：RAPD反应所需的模板量要求低，一次扩增仅需20～100ng DNA样品。模板是决定RAPD产物的主要因素，浓度过低，分子碰撞概率低，产物不稳定；模板浓度过高，增加非专一性扩增产物。RAPD扩增一般使用一个引物，根据引物序列调整反应条件。变性和延伸温度变化不明显，一般分别为94℃和72℃。退火温度对引物影响较大，一般在35～37℃。退火温度过低，引物和模板的特异性结合降低，出现条带可能会增多；退火温度高，则会导致引物和模板特异性结合增加，DNA图谱中条带减少。(www.daowen.com)
c.凝胶电泳：扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶浓度一般为1.5%，电泳电压在50～100V，电泳时间2h左右，紫外光下观察DNA图谱，选择具有多态性的引物。
d.数据分析：图谱分析涉及相关系数、共同带率、平均等位基因频率的计算等。
（6）高通量测序技术目前，基因测序技术发展迅速，已经从第一代Sanger测序技术发展到第三代单分子测序技术。Sanger测序法在测序量和微量化方面具有一定的局限性，第二代高通量测序技术与第三代单分子测序技术的出现，为大规模测序应用提供了技术支持，是DNA测序技术革命性的创新，可以同时对上百万条DNA分子进行测序，具有速度快、准确率高、成本低等特点。目前，第二代高通量测序技术是基因测序中最常用的技术；新兴的第三代测序技术有许多优势，但是仍然存在许多不完善的地方。
①第一代测序技术：第一代测序技术基于Sanger的双脱氧末端终止法和Giber的化学降解法。
a.Sanger测序的基本原理：基于末端终止法。双脱氧核糖核苷酸进行延伸反应，生成相互独立的若干带放射性标记的寡核苷酸；每组核苷酸具有共同的起点，但是随机终止于特定的寡核苷酸残基，形成一系列以特定核苷酸为末端、长度不相同的寡核苷酸混合物；寡核苷酸的长度由特定碱基在待测DNA的位置决定；通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过放射自显影技术直接读出待测DNA的核苷酸顺序。
b.化学降解法基本原理：基于在化学试剂的作用下，DNA链在一个或两个碱基处发生专一性断裂的基本原理。首先对待测DNA末端进行放射性标记，通过4组相互独立的化学反应分别得到部分降解产物，每组反应特异性地针对某一种或某一类碱基进行切割，反应后得到4组带有不同长度放射性标记的DNA片段；每组中的每个片段都带有放射性标记的共同起点，但是长度不同；各组反应物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，通过放射自显影技术检测末端标记的分子，读取待测DNA片段的核苷酸序列。
第一代测序技术读长可达1000bp，准确率高达99.99%，具有很高的可靠性。但是，这些测序技术依赖于电泳分离技术，分析速度和并行化程度较低，耗时长，成本高。
②第二代测序技术：随着后基因组时代的到来，第一代测序技术无法满足基因测序的要求，诞生了第二代测序技术，即高通量测序技术（high-throughput sequencing），其特点是边合成边测序（sequencing by synthesis）。高通量测序技术运行数据量大，可以同时检测数百万个DNA分子。测序平台主要包括Roche公司的454焦磷酸测序、Illumina公司的Solexa聚合酶合成测序以及ABI公司的SOLID连接酶测序。高通量测序技术利用4种颜色的荧光标记不同的dNTP，在DNA聚合酶的作用下合成互补链，每增加一种dNTP会释放出不同的荧光信号，通过计算机处理荧光信号，获得待测DNA序列的信息（图7-5）。
图7-5 三种高通量测序技术示意（Shendure &Ji，2008）
a.454焦磷酸测序的基本原理：在测序过程中，设计带有标签的引物进行PCR扩增，每个样品扩增产物对应一个标签，一次可以完成上百个样品的测序，并根据标签抽取样品序列，进行数据分析。DNA单链PCR扩增时引物杂交，杂交后产物与ATP硫酸化酶、DNA聚合酶、荧光素酶及5′磷酸硫腺苷（腺苷酰硫酸）进行反应，dNTP依次加入引物上。加入的dNTP与模板配对会释放相同数量的焦磷酸基团，ATP硫酸化酶催化焦磷酸基团生成ATP，ATP驱动荧光素酶催化荧光素向氧化荧光素转化，发出与ATP含量呈线性关系的可见光信号。ATP与未反应的dNTP被及时降解，再生反应进入下一个dNTP循环，根据所得信号峰值图获得DNA序列信号。这项技术读取序列长度最长（400bp），但是数据通量低；遇到多聚核苷酸序列时，碱基数量与荧光信号强度不成线性关系，因此不适合检测具有重复序列的DNA片段。
b.Solexa聚合酶合成测序技术：其核心是通过桥式PCR产生可逆性末端终结和DNA簇，基于边合成边测序的原理，每个核苷酸的3′末端带有能够封闭dNTP的3′端黏性基团，恢复3′端基团的黏性后接着合成下一个dNTP，直到测序完成。每个循环只插入一个碱基，这是Solexa技术与454测序技术的差异之一。获得数据通量高，高度自动化，适合小片段DNA的测序。但是读长较短，从头测序具有困难。
c.SOLID连接酶测序：与前两种测序技术相比，SOLID连接酶测序具有双碱基校正的特点。测序反应通常进行5轮，编码区通过碱基编码矩阵定义4种荧光信号和16种碱基对的对应关系。每轮反应含有多个连接反应，测序反应由5种含有磷酸基团且位置上只相差一个碱基的连接引物作为介导连接。已知起始位点的碱基且每次反应后都会产生相应的颜色信号，根据双碱基校正原则和颜色信号即可推断碱基序列。此技术每个碱基读取两次，准确性高，适合检测参考碱基序列；但是测序长度最短（约50bp），读取长度受反应次数的限制。
上述几种测序方法中，454焦磷酸测序所得到的序列可达400bp，为三种测序技术中读长最长者，但是费用高，重复序列出错率高；与454测序技术相比，Solexa测序读长短，导致后续的拼接工作比较复杂；SOLID测序技术的序列通量高，准确度最高，但是测序片段读长短、费用高。
③第三代测序技术：即单分子测序技术，最大特点是不依赖于PCR扩增，避免DNA在扩增过程中出现错误。大致过程为：将待测DNA随机打碎成约200bp的片段，在3′末端加上50bp带有荧光标记的poly A尾巴；退火形成单链，在芯片上与Oligo dT探针结合，利用poly A上的荧光标记进行精确定位；依次加入4种荧光染料标记的单核苷酸，在DNA聚合酶的作用下与模板互补配对并延伸一个碱基，采集荧光信号；剪切去除荧光基团，清洗后进行后续试验。单分子测序技术不再局限于边合成边测序的思想，而是把ssDNA的末端利用外切酶切割成单碱基进行后续实验及检测，这一技术读长更长，并且后续拼接工作简单。但是，测序的错误率较高，结果不够精确，需要进一步改进。
a.Pacific BioScience SMRT技术：基于边合成边测序的原理。每种脱氧核苷酸由不同颜色的染料标记，被荧光标记的核苷酸与模板链结合在聚合酶活力位点上，激发出不同荧光，荧光脉冲结束后被标记的磷酸基团被切割释放，聚合酶转移至下一个位点，下一个脱氧核苷酸连接到位点上进行荧光脉冲，进入下一测序过程。
b.Helico BioScience TRIM技术：是基于全内反射显微镜的测序技术，也是基于边合成边测序的原理进行的。基本操作过程为：将待测序列随机打断成小分子片段，用末端转移酶在小片段的3′末端添加poly A，在poly A末端实施阻断及荧光标记，将小片段与带有poly T的平板杂交，加入聚合酶和被荧光标记的脱氧核苷酸进行DNA合成，每一循环一次加入一种dNTP，之后洗脱去除未合成的DNA聚合酶和dNTP，之后检测模板位点上的荧光信号，将核苷酸上的染料裂解释放，加入下一种dNTP和聚合酶，进行下一轮循环。
3.核酸分子杂交技术
核酸分子杂交技术的基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜温度及离子强度条件等），可按碱基互补配对成双链，用特异性探针与待测样品的DNA或RNA形成杂交分子。主要包括以下几种：Southern杂交、Northern杂交、原位杂交（ISH）、荧光原位杂交（FISH）和芯片杂交。核酸杂交技术具有高度特异性、灵敏性、快速等特点。
（1）Southern印记杂交
①基本原理：自1975年英国科学家Southern E M创立以来，Southern印迹杂交（Southern blot）技术已经成为分子生物学的一种常用的DNA检测技术。此方法具有快速、灵敏、准确等优点。Southern技术的基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补配对的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。基本操作过程是将待测核酸结合到尼龙膜、硝酸纤维素等固相支持物上，然后与存在于液相中已标记的核酸探针进行杂交，探针分子的显示位置及其量的多少，反映出待测核酸的分子质量与大小。
②基本操作过程：Southern印迹使用的标记包括同位素标记和非同位素标记两种。放射性同位素标记的探针灵敏度高，但是存在半衰期的限制，对人体和环境会造成放射性危害。因此，目前使用较多的是非放射性同位素标记，可避免放射性危害，其中地高辛标记探针目前最常用。其技术要点包括以下几个方面。
a.探针的制备：探针的标记方法包括缺口平移法、末端标记法、随机引物法、PCR法等。Southern杂交探针的制备一般使用随机引物法；如果探针两端的序列已知，可以用PCR法制备探针，比用Klenow酶随机标记探针效率高。地高辛标记探针最好使用PCR法。PCR法制备的探针可能会出现非特异性条带，需要对PCR产物进行优化以保证标记探针的特异性。要选择合适的探针浓度，浓度过低则杂交信号较弱，过高则会产生非特异背景。
b.DNA样品的转移及固定：将DNA片段从凝胶转移至固相支持物的方法有5种，包括向上毛细管转移法、向下毛细管转移法、同时向两张膜转移、电转移和真空转移等。经典的凝胶转移方式是由Southern提出的向上转移法，操作简便；但是转移过程中，由于凝胶受压、脱水而变薄，凝胶孔径变小，转移效率下降。向下转移法可以克服上述缺点，转移效率有所提高。将DNA固定在膜上的方法主要有3种，如真空烘烤、微波炉固定和紫外交联。紫外交联法快速、方便，但是紫外交联时要避免膜被过量照射。照射的目的是使DNA的小部分胸腺嘧啶残基与膜表面带正电荷的氨基基团形成交联，过量照射将导致大部分胸腺嘧啶共价结合，继而降低了胸腺嘧啶残基与氨基基团交联的程度。
c.杂交反应：根据所选择的预杂交实验结果确定温度。在满足温度的条件下，杂交的成败取决于杂交时间，时间过短杂交不充分，时间过长则可能导致非特异性结合增多。
d.祛除背景污染：利用地高辛标记探针进行杂交时，容易产生高背景。降低背景常用的措施包括以下两种：适当延长梯度洗膜的时间和提高洗膜温度；控制地高辛抗体的浓度。足够量的地高辛抗体可以获得较好的杂交信号，但过量的地高辛抗体会在膜上产生抗体非特异性结合的斑点。
e.杂交膜的选择与保存：杂交膜包括尼龙膜、硝酸纤维素膜和PVDF膜。尼龙膜是一种较为理想的核酸固相支持物，其结合能力、温度适应性、韧性比硝酸纤维素膜强，是最常用的杂交膜。
（2）Northern印迹杂交Northern印迹杂交（Northern blot）用于研究特定类别的RNA分子的表达模式（丰度和大小），是一种将RNA从琼脂糖凝胶转印到硝酸纤维素膜上的方法。RNA印迹技术与DNA杂交相对应，因此被称为Northern杂交。Northern杂交的原理和方法与Southern杂交相似，但是操作对象不同。Northern印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法相似。利用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性。RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合。可在高盐过程中进行转印，烘烤前用低盐溶液进行洗脱，染色后在紫外光下成像。Northern杂交实验应注意以下问题：①保证RNA的完整性。RNase极其顽固，操作过程中易降解RNA，因此应抑制RNase活性。②印记过程中要降低背景，可以重复进行探针剥离与重探，提高工作效率。③根据G+C含量及同源性计算杂交温度，一般在58～60℃。同源性高的杂交温度较高；适当延长杂交后的洗膜时间及阻断剂处理时间，可以降低背景污染。
（3）荧光原位杂交技术 原位杂交技术（in situ hybridization，ISH）发明于20世纪60年代，通过在环境样品上直接原位杂交，可以测定不可培养微生物的形态特征及丰度，并原位分析群落结构组成。ISH技术的发展经历了放射性标记探针和荧光标记探针两个阶段。1988年，ISH技术被首次引入细菌学研究，利用放射性标记的rRNA寡核苷酸探针检测细菌；1989年，采用荧光标记的16S rRNA序列上特异的寡核苷酸探针来探测独立的微生物细胞，不同的探针使用不同的荧光染料，可以同时鉴定不同类型的微生物细胞。这项技术被命名为荧光原位杂交（fluorescent in situ hybridization，FISH）。FISH技术不需要进行核酸提取及PCR扩增，无需破坏细胞结构，可以展示原位条件下微环境中完整细胞的信息，精确性高，广泛应用于微生物生态学研究领域。
①基本原理：FISH技术是通过双链DNA变性后和带有互补序列的同源单链（探针）退火配对形成双链结构，通过特定分子的标记探针与染色体原位杂交和荧光显色，直接显示特定细胞核或染色体上DNA序列间相互位置的关系。通过将双链DNA变性成为单链结构，带有荧光标记的探针与固定在玻片或纤维膜上的核苷酸序列进行杂交，探测其中所有的同源核苷酸序列，并通过共聚焦激光扫描显微镜或荧光显微镜进行观察。
FISH技术无需核酸提取和PCR扩增等步骤，可以通过荧光标记的探针特异地与互补核苷酸序列在完整的细胞内结合；与放射性探针相比，荧光探针更安全，分辨率更好，无需额外检测步骤；可以利用不同波长的荧光染料标记探针，一次可以检测多个目标序列。
FISH技术也存在着一些不足：（a）FISH检测的假阳性。FISH检测技术的精确性是由寡核苷酸探针的特异性决定的，设计的探针序列检测需要与最常规、最新版本现有的序列数据库进行校对，确保探针序列的特异性。但是，对某些不可培养微生物，没有现成的探针数据库，只能利用点杂交的方法分析探针的特异性。非特异性探针会导致假阳性现象。此外，某些微生物本身具有荧光性，会掩盖特异的荧光信号，干扰FISH检测。（b）FISH检测的假阴性。微生物目标基因丰度过低或者微生物细胞壁渗透性差导致探针无法进入细胞与核酸进行杂交等，导致荧光探针的杂交信号较弱，引起假阴性的产生。可采用优化渗透性、使用高强度荧光染料和多重探针标记等增强杂交信号。
②基本操作过程：包括探针设计、固定标本与预处理样品、探针特异性杂交样品、漂洗去除未结合的探针、检测杂交信号等操作。关键环节为探针标记、荧光染料、FISH的靶序列和杂交。
a.探针与标记：FISH探针长度一般为15～30bp，具备特异性强、灵敏度高、组织穿透力强等特点。常用的探针根据序列特点可以分为3类。染色体特异重复序列探针杂交的目标序列常大于1Mb，不含散在重复序列，与目标位点紧密结合，杂交信号强，易于检测，用于监测细胞间期非整倍染色体。全染色体或染色体区域特异性探针由一条染色体或其上某一区域特异高的核酸片段组成，用于中期染色体重组和间期核型分析。特异位置探针由一个或几个克隆序列组成，主要用于基因克隆、DNA序列定位和检测靶DNA序列拷贝数及其结构变化。
探针的标记方法一般包括直接荧光标记法和间接荧光标记法两种。直接荧光标记法是通过化学合成的方法将荧光染料分子以氨基连接于寡核苷酸的5′端或者用末端转移酶将荧光标记的核苷酸连接于寡核苷酸的3′端。可以通过下述方法增强信号强度：将异硫氰酸荧光素偶联于寡核苷酸；在寡核苷酸两端进行标记，3′端加1个荧光分子，5′端加4个荧光分子。间接标记法是将地高辛或生物素等与探针连接，利用偶联有荧光染料的亲和素或抗体进行结合，可以通过酶促信号放大提高敏感性。
b.荧光染料：不同的荧光具有不同的激发和散射波长，可以利用不同的荧光染料同时观察多种微生物（表7-1）。采用不同的荧光素探针同时检测两种以上微生物时，为避免不同探针之间光谱重叠，荧光染料需要具备狭窄的散射峰。使用荧光染料的基本原则为最明亮的染料要用来检测丰度最低的对象。
表7-1 微生物FISH技术常用的荧光染料
c.探针与同源序列杂交：FISH技术在保持完整细胞形态的条件下，进行细胞内杂交与显色分析DNA或RNA，主要包括以下几个步骤。（a）细胞固定与预处理：常用的固定液包括低聚甲醛、戊二醛、多聚甲醛等。一般采用蛋白酶K、HCl等进行预处理，目的是增加细胞组织的渗透性，以及减少非特异性目标序列的结合。（b）探针特异性杂交样品：这是FISH杂交技术的核心步骤，时间和温度根据探针及样品序列而不同，杂交温度一般在37～50℃，杂交时间30min至若干小时不等。（c）漂洗未杂交的探针：利用48℃水浴的清洗液及冰浴的超纯水进行清洗。（d）封片观察：通常需要结合通用的寡核苷酸探针对微生物样品进行区域界定及不同分类级别的区分。例如，利用细菌通用探针进行杂交时，DAPI染色可作背景界定生物体细胞的区域，并结合其他特异性探针，选择不同颜色的荧光标记，同时进行荧光原位杂交。利用共聚焦激光扫描显微镜或荧光显微镜进行观察。
（4）基因芯片技术随着分子生物学的迅速发展，大量细菌、真菌等微生物基因组测序得以完成，丰富的基因序列信息为微生物的研究提供了重要原始数据库，同时也为基因芯片技术（gene chip technique）的发展和成熟奠定了基础。基因芯片（gene chip）又称为DNA芯片（DNA chip）、DNA阵列（DNA array），是在20世纪90年代中期发展起来的一种新兴的分子生物学技术，综合了生物学、化学、材料学、计算机学等多学科的优势。基因芯片技术可以一次检验上万个微生物或基因，具有通量大、灵敏度高、特异性强等优点，在微生物学领域广泛应用。
①基本原理：基因芯片实际上是一个硅晶体片或玻璃片的固相载体。将DNA探针固定在载体上。固定在载体上的核酸序列与样品核酸序列互补结合，通过核酸杂交的信号获得样品中相应核酸的信息。基因芯片将大量的DNA探针固定在固相基质上，与待测的标记DNA样品进行杂交，一次可以记录上千万的基因表现的形式。
基因芯片的工作原理与Southern、Northern等经典的核酸杂交方法一致，利用已知的核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交，并通过信号检测进行定性与定量分析。基因芯片在微小的基片（硅片、玻片、塑料片等）表面集成了大量分子识别探针，能同时分析成千上万种基因，进行大信息量的筛选与检测分析。
与传统的核酸杂交技术相比，基因芯片技术具有高通量、自动化、微型化等特点，其优势主要表现在：（a）高通量和并行检测。传统的Southern blot技术将待测样品固定在尼龙膜上，与标记DNA探针杂交，每次只能检测一个目标序列；而基因芯片技术将大量的DNA探针固定在固相基片上，与待测DNA进行杂交，每次可以检测上万种基因。（b）高度自动化。基因芯片阵列中某一特定位置的核苷酸序列是已知的，对微阵列每一位点的荧光强度进行检测，即可对样品遗传信息进行定性定量分析。可以利用激光共聚焦扫描显微镜检测杂交信号，利用软件记录分析后直接得出检测结果。（c）操作简单快速。传统方法检测时间一般需要4～7天，而基因芯片技术整个检测过程仅需4h左右。（d）特异性强，灵敏度高。
虽然与传统核酸杂交技术相比，基因芯片技术具有很大的优势，但是在实际操作过程中依然会存在一些问题：（a）检测低拷贝基因时，DNA芯片的灵敏度较低，需要对样品进行PCR扩增以提高检测灵敏度。（b）芯片上的探针进行杂交时，自身会形成二级甚至三级结构，使靶序列难以被检测，降低灵敏性。（c）基因芯片技术上还有一些问题了解不清楚，有待深入研究，例如，探针序列对杂交体稳定性的影响，探针最佳固定方式，探针与载体之间连接臂与探针分子之间的间距对杂交的影响等。
针对目前基因芯片的不足及研究趋势，未来基因芯片技术可能向以下几个方面的发展：（a）高自动化、标准化、简单化，成本降低。目前基因芯片技术的价格较昂贵，这是推广这项技术的主要障碍，但是随着实验技术的更新，基因芯片价格会大大降低。（b）进一步提高探针阵列的集成度。目前基因芯片阵列的集成度可以达到1.0×105，而绝大多数生物体的基因数量低于1.0×105，因此一张芯片可以研究绝大多数生物体的基因表达情况。（c）提高检测的灵敏度和特异性。通过检测系统的优化组合和采用高灵敏度的荧光标记进行改良，通过多重检测来提高特异性，减少假阳性。（d）提高探针的稳定性。DNA探针和RNA探针都不稳定，容易降解。肽核酸探针稳定性较强，可以用来取代普通的DNA/RNA探针。（e）基因芯片技术与其他技术相结合。将基因芯片与蛋白质芯片等其他生物芯片综合使用，可以了解蛋白质与基因间相互作用的关系；将基因芯片技术与生物信息学联合发展，利用生物信息学研制新的基因芯片检测系统和分析软件，构建基因芯片标准数据库，促进芯片数据的存储、分析和交流，以便更有效地利用和共享资源。芯片数据库包括DNA序列和芯片测试结果的基因数据库。这些将大大推动基因组学研究和生物信息学的发展。（f）建立微缩芯片实验室。通过微细加工工艺制作的微滤器、微反应器、微电极等对生物样品从制备、生化反应到检测和分析的整个过程实现全集成，实验过程自动化，缩短了检测和分析时间，节省了实验材料，降低了人为的主观因素，大大提高了实验效率。
②操作过程：主要技术流程包括芯片的设计与制备、靶基因标记、芯片杂交与杂交信号检测。基因芯片的分类方法很多：按照载体上所点探针的长度划分为cDNA芯片和寡核苷酸芯片，根据芯片功能划分为基因表达谱芯片和DNA测序芯片，根据载体可分为液相芯片和固相芯片。虽然基因芯片的种类很多，但是主要操作过程基本一致。
a.芯片的设计与制备：基因芯片的设计是指芯片上核酸探针序列的选择以及排布。根据探针的应用目的决定设计方法。探针序列一般来源于已知基因的cDNA或EST文库，探针序列要与目的基因进行特异性结合，保证探针序列的特异性。
芯片的制备方法主要包括两种类型。按照点样模式，基因芯片划分为点样芯片（spotted DNA arrays）和原位合成芯片（oligonucleotide arrays）两种。制备点样芯片，首先制备探针库，根据基因芯片的分析目标从相关的基因数据库中选取特异的序列进行PCR扩增或直接人工合成寡核苷酸序列，然后将不同的探针分配在玻璃、尼龙等固相基质表面的不同位点，并通过物理化学等方法进行固定。通常在同一芯片上相同的DNA探针会点两个以上的重复进行对照，每张芯片上最多有两万个点。固定在载体上的探针叫做检测探针，一般为完整基因序列或表达序列标签，长度一般为300～800bp。原位合成芯片是在玻璃、尼龙等固相基质表面直接合成寡核苷酸探针阵列，通过原位合成的方法进行制备，寡核苷酸链长度一般为50～70bp。
b.样品的制备与标记：待分析样品的制备是基因芯片技术的一个重要环节。靶基因与芯片探针结合杂交之前需要进行分离、扩增和标记。标记方法根据样品来源、芯片类型和研究目的的不同而有所差异。通常在待测样品的PCR扩增、逆转录或体外转录过程中实现对靶基因的标记。对于阵列密度较小的芯片可以使用同位素，所需仪器为实验室常规使用设备，易于展开工作，但是在信号检测时，一些杂交信号强的点阵列容易产生光晕，干扰周围信号分析。高密度芯片的分析一般采用荧光素标记靶基因，通过适当的内参设置以及对荧光信号强度的标准化可对细胞内mRNA的表达进行定量检测。把不同来源的靶基因用不同激发波长的荧光素标记，并把它们同时与基因芯片杂交，通过比较芯片上不同波长荧光的分布图获得不同样品间差异表达的基因图谱。这种方法叫做多色荧光标记技术。
c.杂交反应：核酸样品和探针之间的杂交反应属于固相杂交，是芯片检测的关键一步。杂交条件因靶分子类型不同而不同，探针浓度、长度，杂交的温度、时间、离子强度等因素是影响杂交反应的关键。根据探针的类型、长度及芯片的应用选择来优化杂交反应条件。未杂交的探针通过漂洗的方式去除，避免背景干扰。
d.信号检测与结果分析：用同位素标记的靶基因，可以用放射自显影技术进行信号检测；用荧光标记的靶基因，需要荧光扫描及分析系统，对相应探针阵列上的荧光强度进行分析比较，得到待测样品的相应信息。基因芯片获得的信息量大，对于基因芯片杂交数据的分析处理需要标准化的数据格式。
4.稳定性同位素核酸探针技术
稳定性同位素核酸探针技术（DNA/RNA stable isotope probing，DNA/RNA-SIP）是将复杂环境微生物物种组成与其生理功能耦合分析的有力工具。微生物的大小在微米尺度，因此，自然环境中微生物群落在微米尺度下生理过程的发生、发展，其新陈代谢产物在环境中累积与消减的动力学变化规律，形成了微生物生理生态过程，决定了不同尺度下生态系统物质和能量的良性循环。利用稳定性同位素示踪复杂环境中的微生物核酸，实现了单一微生物生理过程研究向微生物群落生理生态研究的转变，能在更高更复杂的整体水平上定向发掘重要微生物资源，推动微生物生理生态学和生物技术的开发应用。
（1）基本原理稳定性同位素核酸探针技术是采用稳定性同位素示踪复杂环境如土壤微生物核酸DNA/RNA的分子生态学技术。DNA-SIP的基本原理是，碳氮是生命的基本元素，采用稳定性同位素如13C标记底物培养环境样品。因为合成代谢是所有生命的基本特征之一，利用标记底物的环境微生物细胞不断分裂、生长、繁殖并合成13C-DNA。提取环境样品微生物总DNA并通过超高速密度梯度离心将微生物13C-DNA与12C-DNA分离后，进一步采用分子生物学手段特别是环境组学技术分析13C-DNA，将能揭示复杂环境样品中同化了标记底物的微生物作用者，在群落水平揭示复杂环境微生物重要生理生态过程。RNA-SIP与DNA-SIP的基本原理一致。与DNA-SIP相比，RNA-SIP的研究不依赖于细胞分裂，能够采用更低浓度的13C标记底物培养环境样品，研究结果更接近原位状况，灵敏度更高。
除磷以外，几乎所有具有生物学意义的元素均有两种稳定性同位素，甚至更多。一般而言，重同位素或轻同位素组成的化合物具有相同的物理化学和生物学特性，因此，微生物可利用稳定性重同位素生长繁殖，合成标记的生物大分子如13C-DNA，利用分子生物学技术分析13C-DNA，可在微生物群落水平，以13C物质代谢过程为导向，发掘重要功能基因，揭示复杂环境中微生物重要生理代谢过程的分子机制（表7-2）。目前稳定性同位素示踪复杂环境中微生物核酸DNA/RNA技术得到了国际学术界的高度关注。近年来，该技术在我国也得到了高度的关注和快速发展。
表7-2 基于核酸元素组成的稳定性同位素示踪原理
续表
（2）操作过程DNA/RNA-SIP操作主要包括四个步骤（图7-6）：标记底物培养环境样品，环境微生物基因组核酸密度梯度离心，不同浮力密度区带核酸的13C标记程度鉴定和13C-核酸的下游分子分析。
图7-6 稳定性同位素核酸探针技术示意
①标记底物培养环境样品：在环境样品培养体系中，标记底物和代谢产物通量的动态变化规律是表征微生物生理生态过程及其强度的关键参数，也是判定环境微生物核酸中13C富集程度的重要参考。培养体系中外源标记底物越多，目标环境微生物核酸标记程度就越深。然而，原位研究微生物在自然环境中的新陈代谢途径要求尽可能保持样品的原始状态，尽可能降低外来干扰。因此，理想的培养实验是采用最少的标记底物培养环境样品，得到最小量的、但超速离心能有效分离的标记核酸13C-核酸。
②环境微生物基因组/转录组密度梯度离心：利用超高速密度梯度离心技术即可将环境微生物基因组总DNA/转录组RNA中的13C-DNA/13C-RNA与12C-DNA/12C-RNA有效分离。超高速离心所使用的最佳核酸量取决于单位质量环境微生物总DNA/RNA中13C-DNA/RNA的比例和超高速离心后13C-DNA/RNA的最小检测限。
超高速离心结束后，采用常规的取代法，用针穿刺离心试管底部，然后在试管顶部扎入另外一个针头并通过软管与蠕动泵相连，将水溶液或矿物油以固定流速注入离心试管内，导致离心试管内形成固定的压力，使得试管内不同浮力密度区带的DNA以恒定的流速依次从试管底部流出并收集。超速离心后，将试管内的离心溶液分层为14～16个或22～25个不同浮力密度区带，实验结果并没有明显改善，而后者极大地提高了分子分析的工作量。
免责声明：以上内容源自网络，版权归原作者所有，如有侵犯您的原创版权请告知，我们将尽快删除相关内容。
