蛋白质是生命活动的重要组成部分，经过长期的自然选择，自然界赋予其精美的结构和复杂的生物学功能。生物体中绝大部分的生化反应是由蛋白质中的酶进行催化的。酶的高催化效率、严格的底物专一性是大多数传统的化学催化剂无法比拟的。随着科学技术的发展和人们对酶的结构和功能认识的不断深入，酶在食品、轻工、化工、医药、环保、能源等领域得到广泛的应用。

虽然酶经过了数亿年的自然进化，在生物体内具有特定的生物学功能，然而在其应用过程中，人们注意到酶的一些不足之处，未能满足工业使用的要求。当它们处于机体外复杂的环境时，遇到了许许多多的实际问题。例如，酶蛋白在生物体内的含量不高，难以被提取和制备；酶的稳定性较差，对热、强酸、强碱、有机溶剂等不够稳定；还有代谢产物对酶的抑制作用等。工业生产中通常需要具备以下特性的酶：半衰期长，在极端环境中能保持高活性，能够催化不同底物（包括人工合成的自然界中不存在的底物）等。

自然界中存在至少7000多种天然酶，目前已经鉴定的酶有3000多种，其中具有商品价值的常规酶约有500种，DNA限制性内切酶和DNA甲基转移酶有350多种，多酶混合物约100种以上。由于天然酶十分昂贵，且大多数酶由于非常“娇嫩”而难以实际应用。为了得到能满足实际生产所需要的酶，科学家们需要对天然酶进行酶学性质的改造或是寻找新的具有理想性质的酶。近年来，生物信息学和基因操作技术的发展，使得科学家能够对酶分子结构进行有效的改造，从而改变酶的某些特性和功能。甚至开始了用理性和非理性的方法为“目的”而设计，从而导致分子酶工程学的飞速发展。分子酶工程学就是采用基因工程和蛋白质工程的方法和技术，研究酶的基因克隆和表达、酶蛋白的结构和功能的关系以及对酶进行再设计和定向加工，以发展性能更加优良的酶或者是新功能的酶。分子酶工程的研究热点包括以下三个方面：一是利用基因工程技术大量生产酶制剂；二是通过基因定点突变技术和酶分子定向进化技术对天然酶蛋白进行改造；三是通过基因和基因片段的融合构建具有多功能的融合酶。

本部分主要阐述通过基因定点突变技术和体外分子定向进化技术对酶分子进行改造，把酶分子改造后的信息储存在DNA中，经过基因的克隆和表达，就可通过生物合成的方法不断获得具有新的特性和功能的酶。这些方法相对传统的酶工程通过酶的化学修饰和固定化等方法来改造酶蛋白所需的时间短，目的性和方向性更加明确，而且有些酶的结构和功能研究必须利用现代基因工程密切相关的分子酶工程方法来解决。现代分子酶工程学对酶蛋白的改造方法分为理性设计和非理性设计两大类。

一、理性设计

在理性蛋白设计中，一般需要知道目标蛋白质的编码序列以及对应的空间结构、功能和机制等详细资料。再依据所推测的催化部位和催化机理，对氨基酸序列中要突变的位点进行精确设计，然后通过取代、插入或缺失核苷酸序列等方法来改变蛋白质分子中特定的氨基酸，从而获得与酶特性相关的关键残基和结构元件。理性设计的具体表现形式为定点突变或区域性突变，其主要方法有寡核苷酸引物介导的定点突变、PCR介导的定点突变、盒式突变法和化学合成法。与使用化学、物理和自然因素导致突变的方法相比，理性设计具有目的性明确、突变效率高、简单易行、重复性好的特点。近年来随着结构生物学和生物信息学的发展，这些技术在优化酶特性方面占了重要的地位。

1.寡核苷酸引物介导的定点突变

（1）原理和方法 利用合成的含有突变碱基的寡聚核苷酸片段作为引物，启动单链DNA分子进行复制。该寡聚核苷酸引物作为新合成DNA子链的一部分，所产生的新链具有突变的碱基序列。为了使目的基因的特定位点发生突变，对突变引物的要求除了含有突变的碱基外，其余的碱基与模板完全互补配对。采用化学合成法合成引物，长度一般为15～30个核苷酸，突变碱基应设计在寡核苷酸引物的中央部位，特点是每一轮PCR均需要加入引物。

主要过程：①将目的基因克隆到突变载体上；②制备含有待突变基因的单链DNA模板；③引物与模板发生退火，5′端磷酸化的突变寡聚核苷酸引物，与待突变的模板形成一小段碱基错配的双链DNA；④突变链合成，在DNA聚合酶的催化下，引物以单链DNA为模板合成全长的互补链，然后由连接酶封闭缺口，产生闭环的异源双链DNA；⑤突变基因的初步筛选，将突变的质粒转化到大肠杆菌，利用限制性酶切法、斑点杂交法（利用多核苷酸激酶使突变寡聚核苷酸引物带³²P或地高辛作为探针，进行斑点杂交，由于探针同野生型的DNA之间存在着碱基错配，同突变型却完全互补，于是便可依据两者杂交的稳定性差异，筛选出阳性突变体）或者用其他生物学方法来初步筛选突变的基因；⑥对突变体进行DNA测序鉴定。

（2）改良后寡核苷酸引物所介导的定点突变方法传统的寡核苷酸引物所介导的定点突变方法，由于在转化扩增粒中含有未突变的野生型质粒，且在大肠杆菌中存在着甲基介导的错配修复系统，将细胞中那些尚未被甲基化的新合成的DNA链错配的碱基修复，从而阻止了突变的产生，降低了定点突变率。针对这种情况，Kunkel在1985年对其进行了改进，他在新生的DNA中引入尿嘧啶，降低突变体的修复作用，提高突变效率。近年来，人们对该方法又进行了进一步完善，采用多轮热循环PCR扩增，将全长双链质粒DNA以线性形式扩增，产生一种DNA双链上带交错缺口的突变质粒。

目前国内外普遍使用的简易定点突变技术如下：①采用甲基修复酶缺失的菌株作为受体菌，降低了突变修复能力；②采用改进后的质粒为模板，并改进引物的设计条件；③增加了多个抗生素筛选标记和相对应的多对敲除/修复引物，可在该质粒上进行多次的突变反应。

简易定点突变技术的主要过程分为如下四个步骤：①将待突变的目的基因连接到表达质粒中，构建模板质粒。②加入所设计的含突变位点的PCR引物，进行PCR反应。③反应完毕后，加入DpnI酶消化未突变的野生型模板。DpnI酶能特异性地消化完全甲基化的序列Gme6ATC，而大部分克隆用的大肠杆菌菌株可以将DNA甲基化，而体外合成的DNA则是未甲基化的，所以可选择性地消化甲基化的DNA，而体外合成的DNA则不受影响。④将经DpnI酶处理的质粒进行生物转化，可以通过筛选带有抗生素抗性的大肠杆菌来提取其质粒进行测序验证，再转化至表达宿主中。

该方法与一般PCR介导的定点突变方法相比，其优点在于：①操作简单，任何质粒DNA均可作为模板，而不需要把目的基因克隆到M13产生的单链DNA载体内，省去制备单链DNA模板这一步；不需要特殊的克隆载体和特殊的限制性酶切位点；不需要进行连接反应，可直接将带有缺口的PCR产物转化到宿主细胞，即可得到突变克隆，且不必多次转化及进一步的亚克隆。②快速，突变反应只需数小时，整个突变过程只需1～2天就可以完成。③高效，该方法的突变效率一般大于90%，可以直接用测序来筛选阳性克隆，其成功的关键取决于引物设计和选择恰当的热稳定性DNA聚合酶。

2.PCR介导的定点突变

聚合酶链式反应的出现，推动了定点突变法的发展，为基因的修饰、改造提供了另一条途径。如在设计引物时，在其5′端加入合适的限制性内切酶酶切位点，为PCR产物后续的克隆提供便利。同时可以通过改变引物中的部分碱基而改变基因序列，为有目的地改造基因序列、研究蛋白质结构和功能之间的关系奠定了基础。

（1）重叠延伸PCR该法可在DNA区域的任何部位进行定点突变，需要四种扩增引物，共进行三轮的PCR。前两轮分别扩增出两条彼此部分重叠的DNA片段，第三轮PCR把这两条片段融合起来。它在前面两轮PCR反应中，用两个互补的并在相同的部位具有相同突变碱基的内侧引物，扩增形成两条有一端可重叠的双链DNA片段，且在重叠区段具有同样的突变碱基。由于具有重叠的序列，所以在去除了多余引物之后，这两条双链DNA片段经变性和退火处理，便可形成两种不同形式的异源双链分子。其中一种具5′凹末端的双链分子，不能作为TaqDNA聚合酶的底物，另一种具有3′凹末端的双链分子，可通过TaqDNA聚合酶的延伸作用，产生具有两条重叠序列的双链DNA分子。再用两个外侧引物进行第3轮PCR扩增，就可获得一种突变点远离片段末端的突变体DNA。

（2）大引物突变法经典的大引物PCR定点突变技术需要三条寡核苷酸引物（包括两条外侧正向和反向引物以及内部突变引物）和两轮PCR循环，模板通常是克隆到载体中的野生型目的基因。先由突变引物和相对应的外侧引物进行第一轮的PCR扩增，产物纯化后作为引物与另一外侧引物进行第二轮的PCR反应。最后用两个外侧引物扩增出含突变位点的终产物，如此含突变序列的DNA片段，可进一步克隆到表达载体中进行测序或表达。

3.盒式突变

盒式突变是指利用一段人工合成的含有突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的目标序列。突变的寡核苷酸片段是由两条寡核苷酸链组成的，当它们退火后，会按照设计的要求产生克隆所需要的限制性内切酶黏性末端，这样就会取代野生型目标序列上相同酶切位点的片段。由于不存在异源双链的中间体，因此重组的质粒全部都是突变体，大大减少突变所需要的次数。该方法对于确定蛋白质分子中不同位点氨基酸的功能是很有效的。

近几年来已经利用定点突变技术对天然酶的催化活性、热稳定性、底物特异性、提高表达量、优化代谢途径等方面进行了成功的改造。如朱国萍等人用寡核苷酸引物介导的定点突变方法对葡萄糖异构酶基因进行了体外的定点突变，以Pro138代替Gly138，在酶在比活相近的情况下，其酶的热半衰期比野生型增加一倍，最适反应温度提高10～12℃。Hakamada等用定点突变的方法将细菌碱性纤维素酶的Glu137、Asn179和Asp194突变为Lys，其热稳定性得到提高。莫秋华等人利用大引物PCR的方法对中国人地中海贫血基因进行突变，获得16种稀少突变类型。Gloria等用Phe或Tyr来替代嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶289位的Ala，使其具有了催化醇化反应的能力。

虽然理性设计的方法获得了一定的发展，但它仅适用于三维空间结构、结构和功能关系比较清楚的蛋白质。由于蛋白质的结构和功能的相互关系极其复杂，目前对这类关系的理解仍然比较肤浅，所以当对研究的蛋白质分子结构了解很少时，定点突变技术就显得束手无策。且定点突变技术只能对酶蛋白中少数的氨基酸残基进行替换，酶蛋白的高级结构基本维持不变，因此对酶的改造较为有限。由于在理论上蛋白质分子仍然蕴藏着巨大的进化潜力和改造空间，于是人们开始考虑使用非理性设计——酶分子定向进化的方法来进行酶蛋白的分子改造。

二、非理性设计——蛋白质（酶）分子定向进化技术

在不了解酶分子结构信息、结构和功能之间关系的情况下，通过对酶基因的随机突变和基因片段的重组等方法来构建酶的突变库，然后通过高通量筛选来获得有益突变的方法，称为非理性设计。

酶分子定向进化技术属于蛋白质非理性设计的主要范畴。它们不需要了解酶的空间结构和催化机制，在实验室人为创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外进行酶基因改造，并定向筛选所需特性的突变酶。简而言之，定向进化=随机突变+正向重组+选择（筛选），这样就能在较短时间内完成漫长的自然进化过程，甚至可以在几周的时间内创造出优化的酶，而在天然的进化过程中，得到这个结果需要几千万年之久。酶分子定向进化的实质就是达尔文的进化论思想在DNA分子水平上的延伸和应用。

1.蛋白质（酶）分子定向进化的发展

分子定向进化由Sol Spiegelman及其同事在20世纪60年代利用RNA噬菌体Q进行初次试验。当时它们的目的是为了证明达尔文的进化论也可以发生在非细胞体内。这个分子进化的经典实验在体外模拟了自然进化的过程，为分子水平的定向进化奠定了基础。

改造酶分子性质的定向进化的起点是Hall等在1981年报道的关于定向改变大肠杆菌K12中的第二半乳糖苷酶的底物专一性，开发出对几种糖苷键具有水解能力的酶。他们利用lacZ缺陷型菌株为宿主，分别在含有不同碳源的培养基中培养，从酶的突变库中筛选出可以分别水解半乳糖、乳果糖、乳糖酸的突变酶。1986年Hageman等进行了提高常温生物中酶分子热稳定性的实验，在高温条件下，对携带卡那霉素核苷酸转移酶的突变基因库进行筛选，最终获得63℃和70℃下稳定的突变株。Eige及Kauffman分别在1984年、1993年提出了分子进化的理论。国内张今等人1991年为解决空间结构未知蛋白的改造问题，建立了“随机-定位诱变”的定向进化方法。

这些早期具有开创性的实验，提出了在DNA分子水平上用非理性设计的方法来改造酶分子的新思想。但是由于随机引入突变的技术还不成熟，所以这些实验技术并没有被广泛推广。直到1993年Arnold研究小组应用分子进化的原理，创造性地提出易错PCR技术和1994年Stemmer等发展的DNA改组技术，才标志着酶分子定向进化技术趋向成熟。

近十年来由于科学家们不断探索，创建了许多分子定向进化的新途径和新方法，如外显子改组、家族改组、体外随机引发重组、交错延伸改组等。这些新方法的建立，可以在较小的同源基因库中形成序列信息的多样性和快速产生有益的突变，这在改善酶的性能、优化代谢途径和提高酶的产量等方面具有重大的意义。

2.蛋白质（酶）分子定向进化策略

下面将介绍目前国内外普遍使用的几种定向进化方法和策略，这些方法的侧重点都有所不同，任何方法都不是万能的，应在实际工作中，针对具体问题选择合适的方法或者是不同方法的组合，完成对酶分子的定向进化。

（1）易错PCR技术所谓的易错PCR技术是指在体外扩增目的基因时，利用Taq酶的低保真度，同时调整反应条件，如提高镁离子浓度、加入锰离子、改变dNTP的比例浓度等方法，以一定的频率向目的基因随机引入碱基错配，导致目的基因的随机突变构成突变库，然后选择或筛选出需要的突变体。易错PCR技术的关键就是控制目的基因的突变频率。如果DNA突变频率过高，很多酶将失去活性；如果突变频率太低，野生型的基因背景太高，基因的突变库容量就太小，获得的中性突变太多。对于一般1000bp左右的DNA序列来说，合适的碱基突变数是2～5个。理想的碱基突变率和易错PCR条件，则依赖于随机突变的目的基因序列大小。

通常，经过一次易错PCR获得的突变基因很难达到理想的结果，因此进一步发展了连续易错PCR技术。就是将一轮易错PCR扩增获得的有益突变基因作为下一轮PCR的模板，连续多代地进行随机突变，就能快速积累有益突变，从而获得酶活力改良的突变体。Arnold等应用该方法成功提高了枯草芽孢杆菌蛋白酶E在有机溶剂二甲基甲酰胺（DMF）中的活性。通过连续多轮的突变后，所获得的突变体PC3与野生酶相比，在60%的二甲基甲酰胺溶液中，对多肽底物的水解效率提高了256倍。将PC3再进行2轮的随机突变，产生的突变体13M在60%的DMF溶液中的催化效率比PC3高3倍，比野生酶高了471倍。

由于在易错PCR的方法中，遗传变化只发生在单一DNA分子内部，所以属于无性进化。该方法简单且易操作，但是其能力有限，因为与序列的大小相比，突变库中所含有的突变体数量少，且容易出现同型碱基转换，产生大量的中性突变，从而导致了大量、繁琐的定向筛选和选择过程。

（2）DNA改组技术在酶分子易错PCR进化策略中，一个具有正向突变的基因在下一轮PCR过程中引入的突变是随机的，而且后引入的新突变中有益突变比例仍然很小，在一轮突变后，在突变库中可能产生几个正向突变，其中只有那些被筛选出来的正向突变才能作为下一轮进化模板而传入下一代。因此科学家们发展出DNA改组等基因重组策略，将已经获得的存在于不同基因中的正突变结合在一起形成新的突变基因库。

DNA改组技术又称为有性PCR技术（sexual PCR），是运用基因重组原理来提高酶改造效率的一种定向进化方法。该方法是将正向突变库中分离出来的DNA片段或同源有差异的基因，用DNase Ⅰ随机切割成小片段，这些小片段之间均有部分序列同源，在不加引物的情况下可以互为模板和引物进行PCR扩增，然后加入扩增全长序列的引物进行PCR，获得全长基因。这样就可以使原本存在于不同小片段上的正向突变通过PCR重组到同一DNA链上，最终结果是酶分子的某一性质得到改造或者多个优化性质产生组合。因此DNA改组技术可以有效地进行单基因序列的酶分子定向进化。

Stemmer在1994年首先采用DNA改组技术对β-内酰胺酶进行定向进化，经随机突变获得β-内酰胺酶基因的突变库，然后再进行三轮DNA改组和两轮的亲本回交，筛选出一株比野生型抗性提高32000倍的突变体。Yano等利用DNA改组技术对天冬氨酸氨基转移酶进行改造，结果表明其中6个氨基酸对保持酶活是必需的，但是仅有一个位于酶的活性中心。有科技工作者也用同种方法对水母的绿荧光蛋白进行定向进化，在三轮的改组循环后，得到突变蛋白的荧光信号强度提高45倍的突变体。从1994年到现在的十几年中，DNA改组技术快速发展，已经成功运用于酶分子改造、药物蛋白、小分子药物、基因治疗等领域。

在DNA改组技术的使用中，发现改组过程中伴随较高的点突变效率会阻碍突变库中已经存在的正向突变组合。由于绝大多数的突变是有害的，有利突变组合和稀少的有利突变点会被有害突变所掩盖。于是Zhao和Arnold France利用高保真酶pfu代替Taq聚合酶，并结合Lorimer和Pastan所报道的用Mn²⁺代替Mg²⁺进行DNA改组，其所伴随的点突变效率仅为0.05%。

近年来，人们在DNA改组的基础上提出家族改组技术，就是将天然存在的同源序列、不同种的同一基因或者是同种内的同源基因序列作为DNA改组的模板进行DNA改组。由于不同的同源蛋白在漫长的自然进化中已经具有不同的优良性状，这样获得具有多种有益性状嵌合蛋白的可能性更高。但是当异源重组基因的同源性过高时，由于母本背景太高，导致重组子产率很低。而同源性过低（＜70%）又难以发生重组。Kikuchi等于1999年和2000年提出了家族改组的两种改良方法：一是使用限制性内切酶代替DNase Ⅰ处理DNA片段，重组率由原来的不到1%提高到几乎100%；另外一种是采用单链DNA（ssDNA）来代替双链DNA（dsDNA）进行片段化，降低同源复合体的形成，以提髙重组率。

目前家族改组是各种来源的同源基因重组的首选技术，已应用于多种同源基因产生功能嵌合蛋白库。Hsu等2004年对棒状链霉菌的脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶的8种异源基因进行家族改组，得到K_cat/K_m比原始菌株提高118倍的突变体。还有Hopfner等人从20多个人工分离的人干扰素-α-基因，通过家族改组产生的嵌合蛋白库中，获得了对抗病毒和抗增殖活性均提高的正向突变体。(www.daowen.com)

（3）外显子改组外显子改组是在DNA改组的基础上发展的一项新技术。真核生物的进化是通过亲本基因组之间的有性重组来实现的，其基因的重组是随机的，但是在同源的位置发生。在真核基因中，编码区序列被内含子间隔分开，且外显子仅占基因组的小部分，更多的有性重组是发生在外显子之间而不是外显子内部。因此认为不同分子的内含子间的同源重组可以导致不同的外显子组合，从而获得编码新蛋白的基因序列，此过程即是外显子改组。该方法是产生新蛋白质的有效途径之一。与DNA改组的不同之处在于外显子改组是在同一种分子间内含子同源性的条件下发生的，而DNA改组不受条件限制，可以发生在基因片段的任何位置。

体外进行外显子改组的方法，首先使用嵌合寡核苷酸引物分别扩增编码结构域的外显子或外显子组，然后混合这些PCR产物，经过无引物PCR，使这些混合物连接成不同组装形式的全长基因，形成外显子改组文库。人们可以通过控制参与改组的外显子浓度、不同的混合比例，来获得不同特性的突变库。目前关于外显子改组技术的体外研究报道比较少，Van Rijk等人通过外显子改组技术将仓鼠热休克蛋白A-晶体蛋白基因进行改组，获得了超A-晶体蛋白。Kumagai等通过外显子改组技术获得了新功能蛋白质。这些都说明了通过外显子交换可以产生新功能的蛋白质。因此人为地模仿外显子改组的自然进化过程来定向改造酶分子将是获得新酶的普遍应用方法。

（4）交错延伸重组Zhao等人于1998年建立了一种新的体外DNA重组技术——交错延伸重组技术。它是在PCR反应中将含不同突变位点的模板混合，把常规的退火和延伸合并为一步，并极度缩短其反应时间（5s），这样只能合成非常短的新生DNA片段，经变性，新生链根据序列的互补性与体系内的不同模板退火，并进一步延伸。此过程不断地反复进行，直到获得完整的基因序列。由于在PCR循环过程中模板的不断转换，大多数的新生DNA含有不同亲本的序列信息。

Zhao等利用连续易错PCR技术获得随机突变点，再用交错延伸重组DNA筛选热稳定性高的枯草杆菌蛋白酶，采用连续提高培养温度的方法进行突变菌株的筛选，最终获得一株最适反应温度提高17°C，在65°C半衰期延长200倍的有益突变株。Bluster等也利用该技术对真菌漆酶进行了改造，筛选出酶活力提高1160倍的突变株。由于该技术简单方便，为重组DNA序列进行酶分子改造提供了一条新的途径。

（5）随机引物体外重组Shao等于1998年建立了DNA改组的一种新方法——随机引物体外引发重组（RPR）。以单链DNA为PCR模板，用一套随机序列的引物产生大量互补于模板不同位点的DNA短片段。由于碱基的错配和错误引发，在这些DNA短片段中含有少量的突变碱基。接下来进行的PCR循环中，这些短片段可以互为引物和模板，进行DNA的重组，直到组合成完整的基因序列。再经常规PCR进一步扩增基因序列，随后克隆筛选出阳性克隆子。与常规DNA改组技术相比，RPR具有如下特点。

①可以直接利用单链DNA、mRNA或者cDNA为模板。进行常规DNA改组时，在基因重组前必须将残留的DNaseⅠ去除干净，但RPR则不需要这个过程，可直接进行基因序列的重组。

②RPR所使用的随机引物序列长度要一致，这样不会产生序列顺序的偏向性，使得模板上的碱基发生突变和重组的随机性增强；该方法介导的DNA改组不受DNA模板长度的限制，且模板所需的DNA量比常规DNA改组少很多（仅为常规DNA改组的1/20至1/10）。

Arnold等人利用该方法成功地对耐热枯草杆菌蛋白酶E进行定向改造，获得热稳定性比野生型提高8倍的突变株，经序列测定分析其氨基酸Asn181突变为Asp，Asn218突变为Ser。

（6）酶法体外随机-定位诱变 张今等为了解决空间结构未知酶的蛋白质改造问题，建立了一种酶分子体外定向改造的新途径，即酶法体外随机-定位诱变。该方法与一般酶的体外定向进化方法类似，对目的基因采用随机突变引入突变位点，以快速产生一个突变库。但是其产生的突变点却受到一定限制，这样可减少筛选突变体的工作量。具体通过对DNA合成底物种类和浓度比例的控制，来实现碱基的错配，向目的基因引物突变。利用该技术成功提高了人参多肽基因和天冬氨酸酶基因的酶活力。

（7）合成改组合成改组是定向进化的一种新方法。根据宿主细胞密码子的偏爱性和同源基因的序列一致性，并尽量反映出同源基因中心区的多样性，组合成一系列简并寡核苷酸。通过多轮次的无引物PCR反应，将简并寡核苷酸装配成全长的目的基因。由于所有的基因都是人工合成的，其合成的多样性不受亲本基因的同源性所限制，改变氨基酸来自亲本的倾向性，使其产生的突变体彼此远离，不再簇集在亲本基因周围，大大增加了突变体的多样性。所以大部分合成改组所产生的突变体仅20%是具有组合活性的嵌合酶。Ness等在2002年利用合成改组方法对15种枯草杆菌蛋白酶基因进行定向进化，成功筛选出具有组合性质的嵌合酶。来自15种枯草杆菌蛋白酶母体的多样性被全部编码在30个寡核苷酸中。

（8）截断状模板重组延伸 截断状模板重组延伸（RETT）方法是Lee等人于2003年建立的。该技术是以单链为模板，通过单向延长的特异性引物在模板间的转换完成基因之间的重组。RETT技术主要包括两个关键步骤：①亲本基因用于重组的单链ssDNA片段的制备；②以单链ssDNA为模板，利用PCR重组技术进行全长基因的重组合成。单链ssDNA片段可以通过随机引物对目标基因的RNA进行体外反转录或利用核酸外切酶Ⅲ对亲本基因连续切割而获得。

Kang、Lee等利用该技术对同源性达83%的黏质沙雷菌（Serratia marcescens）ATCC21074和液化沙雷菌（Serratia liquefaciens）GM1403的几丁质酶进行定向改造，筛选出来的重组基因进行序列分析，发现其重组率达70%，且重组位点随机地分布在整个亲本基因序列上。

（9）退火低核苷酸基因重排由于DNA改组过程中，那些未经过重组的DNA序列也包含在突变库中，这样就对突变库的筛选工作增加了难度。Gibbs等应用碱基错配产生随机突变和DNA重排方法来定向改造酶，以退火低核苷酸基因重排法进行DNA重排，利用退火的引物控制已经重排的基因间的重组水平，并减少未经重排的亲本基因的产生。

（10）非依赖序列同源性的重组法DNA shuffling及其衍生的相关技术是进行蛋白质定向进化的有力工具。但其应用过程中对基因序列的同源性要求比较高，对于序列同源性低于70%～80%的基因就很难进行有效的重组，而在自然界中大多数同源序列的相似性都低于这个水平。为了解决在非同源或者低同源基因进行有效重组的难题，近年来发展了许多非同源基因序列重组突变的方法，如RID、RACHITT、ITCHY、SHIPRECA、RMPCR及SCRATCH文库法等。下面将着重介绍RID和RACHITT这两个非依赖序列同源性的重组法。

①随机插入和缺失突变技术（RID）：Murakam等在2002年模拟自然进化中基因的随意插入和缺失的突变过程，建立了随机插入和缺失突变技术。首先，用EcoRⅠ以及Hind Ⅲ来消化目的基因，获取目的片段后，与链节连接。产物再用Hind Ⅲ消化制成有缺口的线性dsDNA，在T4 DNA连接酶作用下环化目的片段，形成反义链有缺口的环状dsDNA，然后，在T4 DNA聚合酶作用下，dsDNA变成环状ssDNA。其次，用Ce（Ⅳ）-EDTA复合物处理ssDNA，在目的基因任意位置上进行断裂，形成线性的ssDNA，在线性的ssDNA两未知末端分别连上一段锚序列，进行PCR扩增。5′端锚序列包括BciV Ⅰ（GTATCC）和Bgl Ⅱ（AGATCT）以及10个碱基的尾巴，3′端锚序列包括了BciV Ⅰ（GTATCC）和10个任意碱基尾巴。由于BciV Ⅰ可以在识别位点下游数个碱基处进行酶切，所以扩增后的PCR产物用BciV Ⅰ处理后，5′端的AGATCT序列就没有切割下来，而3′端的锚序列和目的基因上的3个碱基被消化掉。这样可以在任意位置上产生碱基序列的插入或者缺失，可用特殊的密码子或混合密码子来代替任意选择的碱基，甚至可用编码非天然氨基酸的4个碱基密码子。最后，将消化后的产物用Klenow片段处理成平端，再用T4 DNA连接酶环化，产物用EcoR Ⅰ以及Hind Ⅲ处理，即可进行下一轮的亚克隆了。

RID技术独特的地方是删除位点随机，且外源DNA片段插入位点和删除位点相同，插入和删除片段大小可以控制。通过酶切位点特异性，还可以对特定部位进行突变，非常适合小范围变异的产生。

②过渡模板随机嵌合：过渡模板随机嵌合法与以往的DNA改组技术不同，其利用体外重组构建进化酶的基因库，但不包括热循环、链转移和交错延伸反应，而是将目的基因片段进行随机片段化后，这些小片段杂交到临时的模板上进行基因序列的排序、修剪、空隙填补和连接。临时模板是一条以一定间隙插入尿嘧啶的单链DNA分子。最后临时模板的降解，减少了对野生型序列的影响。且由于RACHITT通过悬垂切割步骤使其所产生的小片段比DNaseⅠ酶消化所获得的片段更小，其重组效率和密度更高，所产生的突变库更具多样性。Coco等于2001年利用该技术对来源不同的二苯丙噻吩单加氧酶进行定向改造，产生的突变库平均含有14个交换体，效率很高。并且可在5bp的序列区间内发生交换，最终筛选获得具有更高反应速率和更广泛底物氧化作用的突变株，对非天然底物的转换效率提高了20倍。

3.定向进化文库的筛选方法

随着定向进化技术的不断发展，人们构建突变基因文库越来越成熟且快速，在蛋白质文库构建好之后，如何从突变基因文库中高效筛选出有益突变体的方法就成为酶体外定向进化实验成功与否的关键。由于所构建的突变库一般很大，且在蛋白质突变文库中大多数是中性或有害突变体，要获得有益突变，往往需要从一个很大的突变基因文库群体中筛选。近年来，随着定向进化技术的不断发展，许多高通量筛选方法也不断涌现出来。下面将着重介绍蛋白质突变文库筛选方法研究进展。

（1）常规筛选方法 当筛选到的突变体蛋白质可赋予宿主细胞或菌落易于观察的信号时，就能通过突变蛋白的酶促反应现象或者检测释放出来的能量、中间产物、抑制剂等，来筛选人们所需要的有益突变。目前，蛋白质突变文库的筛选一般是在固态（琼脂糖和滤膜）或者是液态条件下通过表型选择和筛选完成的。

（2）表型观察选择和筛选 表型观察选择和筛选是建立在细胞生长率和生存率的基础上所构建的蛋白突变文库筛选方法。从细胞生长率考虑的话，主要是根据营养缺陷型互补和对细胞毒素的抗性进行有益突变体的筛选，比如增加抗生素的浓度进行平板筛选。对于生存率而言，则是基于蛋白质突变库中其特异的酶促反应的筛选方法，主要依据强发色体底物（颜色变化）、容易观察的克隆表现（透明圈）或荧光产物来筛选突变体。如将分泌活性蛋白酶的转化菌涂布在琼脂糖平板上，可以产生底物分解圈，而分解圈的大小和酶水解活性成正比。Lee等人根据苏氨酸醛缩酶能催化苏氨酸分解成乙醛和氨基乙酸，再根据乙醛对细胞的毒性，对L-苏氨酸醛缩酶进行定向筛选。菌落分泌出有活性的蛋白酶，可在含有酪蛋白的琼脂平板上产生透明圈。对于直接激发荧光的方法是荧光共振能力转移，最大的优势是可以实时地对细胞内蛋白质与蛋白质相互作用进行动态研究。FRET的底物，通常由荧光团和猝灭剂两部分构成，在酶键断裂后，导致荧光团-猝灭剂或荧光团-荧光团对的分开，释放出荧光，从而进行酶活检测。Georgiou等人利用革兰阴性菌表面带有高负电荷，结合荧光共振能量转移底物的多阳性离子尾巴，使底物附着在大肠杆菌表面，展示在大肠杆菌表面的酶剪切底物的淬灭基团，从而产生相应的荧光，通过FACS进行检测，得到了活性提高了约60倍的突变体。

表型观察筛选法的优点是筛选速度快，省时省力，可以很快地获得优良的突变个体。缺点是具有很大的局限性，如不能达到定量、对蛋白质特性中的微小变化不灵敏，因此不能用来筛选变化小的突变体。21世纪初，数字影像分光光度计的发展大大提高了在滤膜、琼脂糖平板上的筛选通量，并且可以定量筛选突变体产生的信号，提高筛选的灵敏度。

（3）微孔板筛选法由于某些酶无法在琼脂平板上进行检测，所以微孔板悬浮筛选法也被广泛地应用。但是液态酶活测定比固态酶活测定更消耗时间。96孔板微量滴定法是液态酶活测定最常用的一种方法，并且已经从96孔发展到384孔甚至更多。它是当前和机器手臂、液体处理系统、读板仪等最兼容的酶活测定方法，也是最适于自动化、高通量的筛选方法，筛选的结果非常可靠。该方法的优点是测量酶活所需体积较少，还可以从中区分低浓度、弱活性酶的表达克隆。1536孔板和3456孔板以及多通道、多波长检测仪的出现，以及每秒钟分配几千滴样品（pL级）的非接触式压电配样仪的问世，大大提高了这种筛选方法的样品处理速度，从而增加了筛选的通量，节约了筛选时间。这种方法的缺点就是细胞微量培养及处理存在误差，且受限于目前流体分配技术的发展，在开放体系中随着比表面积的增高，会导致蒸发作用和毛细现象等。

（4）新发展的高效筛选方法 近年来，各种表面展示技术呈现出强大的发展势头，已经报道的噬菌体展示技术（phage display）、细胞表面展示技术、核糖体展示技术等比常规筛选方法具有很大的优势。下面着重介绍新近发展起来的表面展示技术。

4.酶分子工程的应用和发展前景

定点突变和定向进化技术对酶分子工程的发展具有重大的影响，短短几年中，酶分子改造技术已成功应用于提高微生物酶在非天然环境中的催化活性、稳定性、底物专一性及表达水平等方面。随着构建突变库方法的不断发展，利用理性设计和非理性设计对微生物酶基因改造也越来越多，并取得了显著的成果。下面着重介绍酶分子工程的应用及发展前景。

（1）提高酶分子的催化活性工业酶催化活性的高低直接影响工业生产的效率以及生产成本，因此提高酶分子的催化活性是酶分子定向进化的基本愿望之一。Okkels等在1995年通过定点突变使南极假丝酵母（Candida antarctica）脂肪酶A的比活力比野生型提高了4倍；You和Aronld等在1996年利用易错PCR技术提高枯草杆菌蛋白酶E的表达水平和在有机溶剂中的活性，酶的催化活性提高了500倍；Zhuo等利用family shuffling技术，对分别来源于大肠埃希菌、嗜柠檬酸克吕沃尔菌（Kluyvera citrophila）和雷氏普罗威登斯菌（Providencia rettgeri）的DNA同源性在62.5%～96.9%的青霉素G酰化酶（PGA）DNA进行改组，从构建的种间青霉素G酰化酶杂合基因库中筛选获得酶活力提高40%的突变株。LiuZ等将D-内酯水解酶基因经过三轮的易错PCR和一轮的DNA shuffling后，从中筛选获得酶活力提高5.5倍的突变体MutE-861，该突变体含有三个点的突变：A352C、G721A以及1038处的一个同义突变。

（2）提高酶分子稳定性 对于工业生产来说，首先要求酶必须具备足够的稳定性，其稳定性包括热稳定性、抗蛋白酶稳定性、在有机溶剂中的稳定性以及不同pH的耐受性等。但是人们从自然界获得的天然酶大都是中温酶，不能耐受各种极端工艺条件而导致其应用受到限制。运用酶分子改造技术，在人工模拟的环境条件下进行酶分子的定向改造，已经成功得到了具有各种特性和功能的工业用酶。

Kim等对栖热菌（Thermus sp.）IM6501的麦芽糖淀粉酶采用DNA shuffling技术，进行4轮的定向改造，筛选获得了耐热麦芽糖淀粉酶，其最适作用温度比野生型提高15°C；在80°C的半衰期是172min，而野生型淀粉酶在此温度下不到1min就完全失去活性；Yamaguchi等将Cys的二硫键引入Humicola lanuginsa脂肪酶中，突变体的热稳定性提高12℃，最适作用温度提高了15℃；Zhao等将枯草杆菌蛋白酶基因经5代的随机诱变后，筛选获得的重组子所产生的枯草杆菌蛋白酶E，在65℃的半衰期为野生型的200倍以上，最适作用温度提髙了17℃；Bessler等利用易错PCR技术和DNA改组技术对解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）的α-淀粉酶进行定向改造，在碱性环境中筛选具有耐受性的α-淀粉酶，获得了一株在pH 10条件下，酶活力比原酶提高5倍的突变株；Patka等发现将南极假丝酵母脂肪酶B72位的M，利用定点突变技术置换成L后，其抗过氧辛酸氧化的作用得到提高。

（3）酶分子对底物专一性的定向改造 利用定向改造技术可以提高或者改变酶分子对底物的专一性。但是要得到完全具有新的底物专一性的酶却是一项极具挑战性的工作，增加酶对底物的专一性，可以使酶更加适应于工业化的生产。

Zhang等利用定向进化技术对β-半乳糖苷酶底物专一性进行了改造，经7轮的DNA改组，从构建的突变库中，采用岩藻糖的发色底物进行筛选，获得岩藻糖苷酶活力提高66倍的突变体。与原来酶相比有6个氨基酸发生改变，其中仅有3个突变位点位于底物结合位点附近。该突变体对邻-硝基苯岩藻吡喃糖苷（ONPE）的专一性比邻-硝基苯半乳吡喃糖苷（ONPG）提高了1000倍。筛选获得的改良岩藻糖苷酶对底物的K_cat/K_m比值，比大肠杆菌自身的岩藻糖苷酶提高了10～20倍；Zhang等研究了禾草腥黑粉菌（Tilletia fusca）纤维素酶Ce16A表面残基对底物专一性的影响，结果突变体R237A、K259H对羧甲基纤维素的活力得到显著提高。Hsu等对棒状链霉菌的脱乙酰氧基头孢菌素C合成酶8种异源DNA进行family shuffling，得到了K_cat/K_m值比原始菌株提高了118倍的突变体。另外通过DNA改组技术对底物专一性进行改造的还有脂肪酶、核酶、细胞色素C过氧化酶、磷酸酯酶和β-内酰胺酶等。

如今，酶分子改造技术已经被广泛应用于DNA的体外定向进化，并出现了一系列具有重要工业价值或商业意义的蛋白，大大加速了DNA进化的进程。酶分子定向进化更被认为是“一场达尔文做梦也没有想到的进化革命，是再设计生命世界的开端”。其不仅在农业、石油化工、人类基因治疗、小分子药物、疫苗研究等领域具有广阔的应用开发前景，而且它也非常适合于基础理论的研究。通过定向进化技术得到的突变体进行分析，来研究蛋白质的结构和功能的关系，可为蛋白质的理性设计提供理论依据，使理性设计更能发挥其应有的作用，以实现蛋白质的有效改造。

近年来，国际上又提出了蛋白质全新设计的概念，即从氨基酸一级序列出发，设计自然界中不存在的全新蛋白质，使之具有特定的空间结构或预期的功能。由于该技术尚未成熟，还处于探索阶段。而2003年Kuhlman等成功地设计了一个93个残基的具有全新拓扑结构的结构蛋白质，向人们展示了这一研究领域的美好前景。分子体外定向改造技术的发明和发展将为人类带来巨大的福音，但同时也可能创造出危害人类和自然平衡的物质，因此人们必须在保证安全性的基础上进行DNA改组的研究和应用。

三、高通量筛选技术

在工业微生物育种过程中，无论是传统的诱变育种、杂交育种、现代基因工程育种，以及近几年出现的定向进化技术育种，建库后，都要对文库进行筛选。而文库的库容量很大，各个样品的质量参差不齐，具有很大的随机性。使用传统零敲碎打的筛选方法，筛选量低，概率小，工作量大，要耗费大量的人力物力。这种背景下，高通量筛选技术（high-throughput screening）孕育而生。本文拟对近几年出现的高通量筛选技术做一简单介绍。由于高通量筛选并无统一的模式程序，要想做好筛选，必须根据实验室具备高通量筛选仪器设备、技术及自身样品的实际情况，将前人的各种方法有机结合，摸索出适合自己的一套筛选方法。

高通量筛选技术的核心思想有两个。第一，必须根据目的样品的特性（理化特性、生物学特性等）开发出合适的筛选模型，将样品的这些特性转化成可以用摄像头和计算机传感器识别的光信号或者电信号；第二，要有自动化或者半自动化的实验操作系统，能够进行移液、接种、清洗等设备操作，而且必须具备以下特点：具有在高洁净度下工作的能力，不引起污染，可多通道一次性进行多组操作，操作速度快，具有良好的软件和硬件兼容性，能与监测设备对接，实验数据可以在多种软件平台上进行分析，能使用各种通用型规格的耗材。

目前世界上对于高通量筛选的研究主要集中在“药物高通量筛选”和“工业生物技术高通量筛选”两个领域，虽然同为高通量筛选，主要思路相同，但是由于筛选物质的不同，故在具体的筛选方法上也有一些区别。本章节主要介绍“工业生物技术高通量筛选”。

高通量筛选技术在很大程度上依赖于自动化、高效率的实验室仪器装备，从而提高了工作效率，将实验员从传统、繁重的手工操作中解放出来，并且提高了筛选数量。微孔板是一种透明塑料板，板上有多排大小均匀一致的小孔。微孔板上的每个小孔可盛放几十到几百微升的溶液。其常见规格有96孔板、384孔板等多种，在现代高通量筛选中，甚至出现了1536孔和3456孔的微孔板。不同的仪器选用不同规格的微孔板，对其可进行一孔一孔或者一排一排地检测。微孔板具有统一的规格，可以使用多通道移液器或者机器人臂、全自动移液工作站实现移液操作。在微孔板上，可以直接加入灭菌培养基，接种微生物，进行培养。微孔板也可直接放入酶标仪，对每个孔中液体的OD值进行测定。