1991年Bailey和Stephanopoulos等在同一期Science分别发表 Toward a Science of Metabolic Engineering和Network Rigidity and Metabolic Engineering in Metabolite Overproduction两篇重要文章，标志着“代谢工程”这门学科的诞生。Bailey将代谢工程的概念定义为，利用重组DNA技术操纵细胞的酶合成和调节功能来改进细胞的活性。经过20多年的发展，代谢工程已成为分子生物学和基因工程的紧密结合体，其研究内容主要集中在通过改造和修饰微生物的代谢途径，以获得新的代谢物、生产外源蛋白以及改进已知代谢途径三方面。

在微生物发酵工业中，人们利用各种微生物资源来获取微生物产生的各类代谢产物。但是由于微生物本身固有的遗传特性限制，在其生长繁殖过程中，它们总是对其自身所需的各种物质和能量“精打细算”，因此仅通过发酵工艺调控很难大幅度提高特定代谢产物的得率。代谢工程的研究内容就是如何打破这种微生物原有的代谢平衡，以获取某种代谢产物的大量积累。代谢工程需要解决的第一个问题，就是如何将微生物细胞的整个代谢网络进行定量分析。解决了这个问题，才能以此为依据进行NDA重组、代谢网络重建、改变代谢流分布，进而提高产品的得率。代谢流分析（metabolic flux analysis，MFA）就是一种定量分析细胞代谢网络的方法。这是细胞生理和代谢工程的重要研究手段。对于已知途径而言，进行代谢流分析是要了解生物过程环境的变化对代谢流分布的影响，确定流向终产物的比例；而对于未知途径，主要是鉴别途径，了解副产物途径，以便指导遗传操作，克服微生物自身的遗传抑制。

代谢途径（metabolic pathway）为一连串可以进行并可观测的生物化学反应步骤，这些反应步骤被指定的一组输入和输出代谢物所连接。代谢流（metabolic flux）为输入代谢物反应生成输出代谢物的比速率，也称为代谢通量或代谢流量。各种代谢途径进一步组合成细胞代谢网络，其中所有途径的代谢流就是代谢流分析的最终定量结果。

代谢流分析的基本假设是，当细胞处于稳态培养状态时，代谢物的积累速率为零，总输入和输出代谢物的流量平衡。那么，利用胞内主要代谢途径的反应化学计量关系与代谢物的质量平衡关系，以及一组胞外流量（比底物消耗速率和比产物生成速率）作为计算的已知量，就可以计算出胞内流量的估计值。计算的结果是一幅代谢流分布图（图5-16）。在微生物的营养需求中，碳源是一个重要的营养要素。它不仅在分解代谢中提供能量，还为细胞合成提供所需结构单元的前体代谢物。因此，在代谢流分析中，所选择的网络一般都集中在碳代谢上。图5-16反映了底物葡萄糖进入细胞后，碳流在胞内的主要已知代谢途径及其稳态流量分布。从图中可以很直观地看到，代谢途径中各步反应对细胞生长过程中的底物利用和产物形成所做的贡献。例如，在A条件下，第一步葡萄糖进入细胞生成6-磷酸葡萄糖时的流量是100%，之后生成6-磷酸果糖进入EMP途径的流量是92.1077%；这部分碳源会继续分解产能，合成糖原物质的流量是0.7943%，而生成5-磷酸核酮糖进入PP途径的流量是5.9150%。PP途径能产生大量的还原力NADPH，5-磷酸核酮糖进一步生成5-磷酸核糖的流量是4.6489%。5-磷酸核糖可用于合成核苷酸等物质。代谢流分布图的另一个更重要的作用是，反应遗传和环境扰动变化后，胞内代谢流的分布差异。例如，在图5-16中，比较简单的环境变化，从A条件pH 6.8变化到B条件pH 7.2时，从代谢流分布图中也可以很清楚地看到两种不同环境条件下的流量差别。正是通过比较这种差异，遗传和环境扰动的影响才能得到充分评价，而且代谢网络中的特定途径及其反应的重要性才能被准确的描述。此外，通过代谢流分析还可以识别代谢网络中的重要分支节点、识别新的或替代途径、计算最大理论得率和最优流量分布、为代谢控制提供必需的流量信息等。

一、基本原理

代谢流是细胞生理学最基本的量度，它使用速率的数学术语来描述胞内各种代谢物流经各自途径的情况。在细胞内，某种代谢物的速率，即浓度随时间的变化可以表示为：

式中，c_i是某种代谢物i在细胞内的浓度，mmol/g；r_i是该代谢物的净累积速率，mmol/（g·h）；μc_i表示由于细胞生长而对代谢物i的稀释效应。

在细胞内，大多数代谢物有着非常高的周转，即使培养环境发生强烈扰动，胞内的各种代谢物也会迅速达到新的平衡水平，因此，胞内代谢物的拟稳态假定是合理的。根据拟稳态假设，则代谢物在胞内的浓度恒定或者说净积累速率为0，即：

由于大部分途径中代谢物的胞内水平都十分低，因此由于细胞生长引起的稀释影响很小，一般可以忽略，则可以得到简化的速率平衡方程：

式（5-9）是进行胞内代谢物质量平衡计算的基本公式。

图5-16 一株重组大肠杆菌在不同pH条件下有氧发酵的代谢流分布示意

培养条件 A：pH 6.8；B：pH 7.2

代谢中间体的缩写：α-KG—α-酮戊二酸 3PG—3-磷酸甘油酸 AcCoA—乙酰-CoA E4P—4-磷酸赤藓糖

F6P—6-磷酸果糖 T3P—3-磷酸丙糖 G6P—6-磷酸葡萄糖 IsoCit—异柠檬酸 OAA—草酰乙酸

PEP—磷酸烯醇式丙酮酸 Pyr—丙酮酸 Rib5P—5-磷酸核糖 Ribu5P—5-磷酸核酮糖

Sed7P—7-磷酸景天庚酮糖 Xyl5P—5-磷酸木酮糖

代谢产物缩写：Ala—丙氨酸 Arg—精氨酸 Asn—天冬酰胺 Asp—天冬氨酸 Cys—半胱氨酸

Gln—谷氨酰胺 Glu—谷氨酸 His—组氨酸 Ile—异亮氨酸 Leu—亮氨酸 Met—甲硫氨酸

Phe—苯丙氨酸 Pro—脯氨酸T hr—苏氨酸 Try—酪氨酸 Val—缬氨酸

1.不考虑细胞生长的代谢流分析

首先设定一个系统作为研究对象：假定一个代谢网络，包含有K种胞内代谢物，J个胞内反应，N种底物，M种产物，不考虑细胞生长因素。在这个系统中，底物和产物存在通过细胞膜的运输，在细胞外可以较容易地测定它们的流量。它们的流量可以称为胞外流量（或运输流量），如比底物消耗（吸收）速率和比产物生成（分泌）速率。而胞内代谢物则不存在跨膜运输。在稳态条件下，胞内代谢物的浓度变化符合式（5-9）。在不采用特殊方法（如放射性元素标记）定量检测胞内反应流量的前提下，胞内反应的流量一般都是未知量。这些胞内流量实际上就是代谢流分析的主要求解目标。

不考虑细胞生长因素，那么对于胞外流量有N+M个质量平衡方程：

式中，r_n，S是第n种底物的胞外流量（比底物消耗速率）；r_n，P是第n种代谢产物的胞外流量（比产物生成速率）；α_n，i是该代谢物在第i个胞内反应中的化学计量关系；v_i是第 i个胞内流量（胞内反应速率）。

这两组方程提供了胞外流量与胞内反应之间的计算关系式，实际上是为整个质量平衡方程组提供了已知量，比底物消耗速率为代谢网络最初的反应步骤输入已知流量，比产物生成速率为代谢网络中间或末端产生的代谢产物的步骤输入已知流量。

对于胞内代谢物，其净积累速率为0，根据式（5.9）可列出K个质量平衡方程：

这组方程提供了胞内流量之间的计算关系式，它的求解过程实际上就是将式（5-10）和式（5-11）的已知流量代入式（5-12）计算获得v_i的过程。

如果将式（5-10）、式（5-11）和式（5-12）组成方程组合在一起写成矩阵形式，则有：

式中，r为N+M个胞外流量构成的列向量；0为K个0构成的列向量；v为J个胞内流量构成的列向量；A为代谢网络的化学计量关系矩阵。

其行列数为（N+M+K）×J，矩阵的行对应N+M+K种代谢物，列对应J个胞内反应。在化学计量关系矩阵中，其行列的排列要与式（5-13）左侧的列向量排列匹配，一般向量r的元素首先是N个比底物消耗速率，然后是M个比产物生成速率，之后是K个0。因此矩阵A的排列方式为：前N行为底物的化学计量关系，第N+1行至第N+M行为代谢产物的化学计量关系，第N+M +1行至N+M+K行为K个胞内代谢物的化学计量关系。

在式（5-13）中，共有N+M+J个流量和N+M+K个平衡方程，系统的自由度F=J-K，其中底物和代谢产物的胞外流量可以通过测量得到，因此共有N+M个已知流量。当N+M≥F时，就能计算出方程矩阵中所有未知的流量。

例5.1 对图5-17所示的简化代谢网络进行代谢流分析。

图5-17 简化的葡萄糖发酵代谢网络

G6P—6-磷酸葡萄糖 PEP—磷酸烯醇式丙酮酸 Pyr—丙酮酸

AcCoA—乙酰辅酶A AcP—乙酰磷酸 LA—乳酸 Eth—乙醇 AcA—乙酸

在图5-17所示的代谢网络中，有1种底物（葡萄糖）、3种代谢产物（乳酸、乙醇和乙酸）、5种胞内代谢物（G6P、PEP、Pyr、AcCoA和AcP）、8个胞内反应。在不考虑细胞生长的情况下，共有4个胞外流量：r_S、r_PL、r_PE、r_PA和8个胞内流量：v₁、v₂、v₃、v₄、v₅、v₆、v₇、v₈。

首先，将8个胞内反应方程列出，将反应方程式写成等式的形式，注意方程中的生成物取正号，反应物取负号，这样可以很直观地体现反应式中的化学计量关系，特别是系数的正负号。

v₁：6-磷酸葡萄糖-葡萄糖=0

v₂：2磷酸烯醇式丙酮酸-6-磷酸葡萄糖=0

v₃：丙酮酸-磷酸烯醇式丙酮酸=0

v₄：乳酸-丙酮酸=0

v₅：乙酰辅酶A-丙酮酸=0

v₆：乙醇-乙酰辅酶A=0

v₇：乙酰磷酸-乙酰辅酶A=0

v₈：乙酸-乙酰磷酸=0

底物葡萄糖只参与反应v₁，与其余胞内流量的计量关系全部为0，其平衡方程为：

r_S=-1· v₁+0· v₂+0· v₃+0· v₄+0· v₅+0· v₆+0· v₇+0· v₈

同理，3种代谢产物的平衡方程为：

r_PL=0· v₁+0· v₂+0· v₃+1 · v₄+0· v₅+0· v₆+0· v₇+0· v₈

r_PE=0· v₁+0· v₂+0· v₃+0· v₄+0· v₅+1 · v₆+0· v₇+0· v₈

r_PA=0· v₁+0· v₂+0· v₃+0· v₄+0· v₅+0· v₆+0· v₇+1 · v₈

5种胞内代谢物的平衡方程为：

6-磷酸葡萄糖：0=1 · v₁+（-1）v₂+0· v₃+0· v₄+0· v₅+0· v₆+0· v₇+0 · v₈

磷酸烯醇式丙酮酸：0 =0· v₁+2· v₂+（-1）· v₃+0· v₄+0· v₅+0· v₆+0· v₇+0 · v₈

丙酮酸：0=0· v₁+0· v₂+1 · v₃+（-1）· v₄+（-1）· v₅+0· v₆+0· v₇+0 · v₈

乙酰-CoA：0=0· v₁+0· v₂+0· v₃+0· v₄+1 · v₅+（-1）· v₆+（-1）· v₇+0 · v₈

乙酰磷酸：0=0· v₁+0· v₂+0· v₃+0· v₄+0· v₅+0· v₆+1 · v₇+（-1）· v₈

因此，可以组成方程组矩阵为：

方程组的自由度F=J-K=3，因此测得4个胞外流量（r_S、r_PL、r_PE、r_PA）中的至少3个就可以计算出剩余所有的流量（包括未检测的胞外流量和8个胞内流量），最终将得到由12个流量所组成的代谢流分析结果。

从上面的矩阵计算结果可以看到，前4个胞外流量平衡方程，其实就是给与之相关的胞内流量赋值的等式，v₁=-r_S，v₄=r_PL，v₆=r_PE，v₈=r_PA。正是这些简单的等式建立了胞内代谢水平与胞外宏观状况的联系，为平衡方程组的求解提供了已知量的输入。因此，选择代谢网络时，要尽可能包括那些涉及代谢物分泌到胞外的途径，这对是否能获得代谢流分析结果至关重要。而5个胞内代谢物的平衡方程则给出了胞内流量之间的关系，根据已知的v₁、v₄、v₆、v₈求解方程组即可得到其他未知胞内流量。

另外，还可以发现v₁=v₂，2 v₂=v₃，这些胞内流量呈现了简单的线性关系。拟稳态假设的一个推论是，只需考虑位于代谢网络分支点的代谢物，而代谢网络中的一些线性途径可以合并为一个反应。因此，图5-17中的v₁、v₂、v₃可以合并为一个反应：2丙酮酸-葡萄糖=0。合并之后会减少两个胞内代谢物6-磷酸葡萄糖和PEP，少了两个平衡方程，但相应的胞内流量也会减少2个，因此对于系统的自由度没有任何影响。经过线性途径合并之后，代谢网络的复杂程度明显降低，进而使化学计量关系矩阵的行列数减少，从而方便计算。例5.1如果进行上述合并简化后，化学计量关系矩阵将从9×8减少到7×6。此外，可以根据实际情况将代谢网络中的分支途径简化成线性途径，如果某个分支途径的流量远远小于另一个分支途径的流量，那么这个分支途径就可以进行简化。例如，细胞处于停止生长的状态（比生长速率为0），或者在含有大量前体代谢物的丰富培养基中生长时，EMP途径中的前体代谢物流向生物合成途径的流量非常小，可以将甘油醛-3-磷酸到丙酮酸的途径看成一条线性途径，即简化了3-磷酸甘油酸、磷酸烯醇式丙酮酸等前体代谢物参与生物合成的分支途径。

需要注意，在进行途径简化时，一定要有足够的实验数据或文献资料为依据，切不可想当然地随意简化。事实上，对代谢网络的整理和合理简化是代谢流分析的重要前提，因为胞内的代谢网络是十分复杂的，有线性途径、分支途径、循环途径及并行途径等，如果不进行一定的假设和合理简化，其计算量将十分巨大，经常还会出现由于无法获得足够的已知量而无法求解的情况。

2.考虑菌体生长的代谢流分析

如果考虑菌体生长，则需要增加一个生物量合成反应：

式中，X——菌体生物量；m_i——代谢物（N+M+K种）；β_i——代谢物i在生物量合成反应中的化学计量关系。

所以这个数学式就表示，把所有代谢物用于生物量合成的那部分全部加起来就等于菌体生物量。生物量化学式可以通过元素分析法和组分分析法测得。元素分析法是将一定量的干菌体灼烧，然后分析燃烧产物，得到元素组成，并结合灰分比例，就可以确定生物量化学式。生物量的一个标准元素组成通式是CH_1.8O_0.5N_0.2。需要注意的是，微生物在不同的培养条件下，其生物量化学式是有一定差异的，需要通过实验验证才能获得较准确的化学式。例如，通过元素分析法测得，在非限定培养基上培养的大肠杆菌的碳摩尔化学式为CH_1.94O_0.52N_0.25P_0.025，灰分5.5%。组分分析法是分析细胞中蛋白质、核酸、脂类等大分子的化学式，再测定这些物质或其单体在细胞中的含量，进而确定生物量化学式。

把胞内所有的代谢物全部写入生物量合成反应的平衡方程中显然并不合适，一种常用的生物量合成的化学计量关系简化方法是，只考虑NADH、NADPH、ATP以及10种主要前体代谢物（6-磷酸葡萄糖、5-磷酸核糖、4-磷酸赤藓糖、3-磷酸甘油醛、3-磷酸甘油酸、磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸、乙酰辅酶A、α-酮戊二酸和草酰乙酸）参与生物量合成，其他代谢物的化学计量关系均为0。当然除了这10种前体代谢物外，如果需要也可增加其他关键的代谢物，但数量不宜过多。微生物细胞的主要结构组成物质是蛋白质、核酸、脂类和多糖，构成这些物质的单体相应为氨基酸、核苷酸、脱氧核苷酸、磷酸酯、脂肪酸、单糖，这些化合物可以通过组分分析实验测定。例如，在表5-3中列出了经过组分分析得到的大肠杆菌细胞的主要单体组分含量，表5-4列出了一些单体合成时所需要的10种关键前体以及辅助因子和能量的化学计量关系。那么将表5-3和表5-4结合起来就可算出大肠杆菌生物量合成反应对10种关键前体代谢物以及辅助因子和能量的需求量，进而即可列出生物量合成的平衡方程。表5-5列出了一些文献报道中大肠杆菌生物量合成反应对前体代谢物的需求量。这些数据分别是Varma、Holms、Stephanopoulos和Goel的研究结果，这些数据基本上是接近的，但在Holms和Goel的研究中将PP途径简化为非循环式的，所以差别比较明显。

表5-3 大肠杆菌主要细胞组分

表5-4 单体合成所需前体的化学计量关系

续表

①合成UDP-NAG和UDP-NAM需要的前体代谢物是果糖-6-磷酸，此处以葡萄糖-6-磷酸计算并不影响。

注：表中缩写：G6P，葡萄糖-6-磷酸；Rib5P，核糖-5-磷酸；E4P，赤藓糖-4-磷酸；G3P，甘油醛-3-磷酸；3PG，3-磷酸甘油酸；PEP，磷酸烯醇式丙酮酸；Pyr，丙酮酸；AcCoA，乙酰辅酶A；α-PG，α-酮戊二酸；OAA，草酰乙酸；NAG，N-乙酰葡萄糖胺；NAM，N-乙酰胞壁酸。

表5-5 大肠杆菌对前体代谢物的需求量

注：数据A来自 Varma，数据B来自 Holms，数据C来自 Stephanopoulos，数据D来自 Goel。

在考虑菌体生长的情况下，可以把生物量合成反应看作一个胞内反应，其流量是μ，把生物量看作一种产物，其胞外流量可表示为r_X，而且在稳态条件下μ和r_X是相等的，即细胞的比生长速率。

因此，如果考虑菌体生长，就要在式（5-13）的基础上，增加一个胞内反应（生物量合成反应）和两个流量（μ和r_X），则可表示为式（5-15）的形式：

式中，（r_X，r，0）^T中，r为N+M个胞外流量构成的列向量；0为K个0构成的列向量。

当考虑菌体生长时，总共有N+M+J+2个流量和N+M+K+1个平衡方程，方程组的自由度为F=J-K+1，与式（5-13）相比自由度增加了1，但同时也多了一个可测的胞外流量r_X，因此对方程组的求解没有影响。

例5.2 将大肠杆菌的厌氧发酵途径简化，将生物量、乳酸、乙醇、乙酸的代谢途径都简化成线性途径，分别用1步反应表示。这些物质直接由葡萄糖合成，忽略其他分支途径（图5-18）。假设其中的反应方程式如下，利用这个简化的代谢网络途径进行考虑细胞生长时的代谢流分析。假设胞内反应方程如下所示。

乳酸合成v₁：2乳酸+2 ATP-葡萄糖=0

乙醇合成v₂：2乙醇+2ATP+2CO₂-葡萄糖=0

乙酸合成v₃：2乙酸+4ATP+2CO₂+2NADH-葡萄糖=0

生物量合成μ：生物量-葡萄糖-13ATP-1.56NADH=0

图5-18 大肠杆菌厌氧发酵的代谢网络简图

把生物量合成看作一个胞内反应，仅考虑底物葡萄糖的参与；而考虑10种前体代谢物的生物量合成方程会更加复杂一些。因此，共有4个胞内流量：v₁、v₂、v₃、μ，6个胞外流量：r_X、r_S、r_L、r_E、r_A、r_C。其中共有1个底物：葡萄糖（S）；5个产物：生物量（X）、乳酸（L）、乙醇（E）、乙酸（A）和二氧化碳（C）；2种胞内代谢物：ATP和NADH。可以列出8个平衡方程。

细胞量：r_X=μ

葡萄糖：r_S=-v₁-v₂-v₃-μ

乳酸：r_L=2 v₁

乙醇：r_E=2 v₂

乙酸：r_A=2 v₃

二氧化碳：r_C=2 v₂+2 v₃

ATP：0 =2v₁+2v₂+4v₃-13μ

NADH：0 =2v₃-1.56 μ

根据式（5-15）可以得到该模型的矩阵表达式：

式中，共有10个流量，8个平衡方程，自由度 F=2，因此只需要从6个胞外流量中测得2个流量就可以解方程组。

二、基于测量数据的代谢流分析

1.正定系统

对于较小规模的代谢网络，在很多情况下可测量的胞外流量数N+M（细胞量作为1种产物）大于或等于系统的自由度F=J-K（细胞量合成反应作为1个胞内反应），因此可以通过测量数据进行代谢流分析。系统能够求解的基本条件是测量数据至少有 F个，也意味着最多有N+M-F个胞外流量是无需进行测量的，它们可以通过求解平衡方程组得到。这种刚好有F个流量被测量的系统，称为正定系统（determined system）。

为了计算方便，将式（5-13）进行分割，得到式（5-16）

式中，向量r被分割成的两个列向量r_c和r_m，r_m的元素为所有被测量的F个胞外流量，r_c的元素为剩余N+M-F个未被测量的胞外流量。同样地，矩阵A分割为A₁和A₂两个矩阵：A₁为矩阵A的前N+M-F行，A₁是（N+M-F）×J的矩阵，与向量 r_c对应；A₂为矩阵A中其余F+K=J行，A₂是J×J的方阵，与向量（r_m，0）^T对应。可以将式（5-16）写成两个方程组：

将测量数据代入式（5-18）中，就可以计算得到胞内流量v：

再将算得的胞内流量v代入式（5-17）中，就可以计算得出其余未被测量的胞外流量。这里需要注意，式（5-18）有解的前提条件是A₂为非奇异矩阵，即方阵A₂的行列式不等于0。造成A₂奇异的原因有三种，介绍如下。

（1）在化学计量关系矩阵A中出现了线性相关的列。化学计量关系矩阵A的列和代谢网络模型中的胞内反应相对应，如果由于某种原因一个或多个胞内反应线性相关，那么这种相关性也会转移到矩阵A₂中，使A₂奇异。线性相关的反应很少在简单代谢网络中出现，但在较大的代谢网络中经常出现。例如，在例5.1中的简单代谢网络中，假设存在一个反应v₉：LA-PEP=0（图5-19）。

图5-19 葡萄糖发酵代谢网络示意

则从PEP到LA存在两条并行途径，一条由反应v₉单独组成，另一条由反应 v₃和反应v₄组成，那么此时，存在计算关系：

可以看到，矩阵A的第3、4列和第9列线性相关，第3列+第4列=第9列。由于多了一个胞内反应v₉，系统的自由度F=4，所以4个胞外流量r_S、r_L、r_E、r_A都必须被测量，因此矩阵A=A₂，它是一个（9×9）的方阵，通过计算不难算出=0，是一个奇异矩阵，造成方程组无法求解。

（2）在化学计量关系矩阵A中出现了线性相关的行。化学计量关系矩阵A的行和代谢网络模型中的代谢物相对应，如果某些化合物的计量关系一致或呈线性相关，即可造成行向量的线性相关。对于一般代谢物而言，不会发生这类情况，但如果代谢网络模型中出现成对的辅助因子如NADH/NAD ⁺、NADPH/NADP ⁺或ATP/ADP时，由于辅助因子对中的两种代谢物必定会同时参与某一反应，并且它们的化学计量关系大小相同、正负相反，这样就会造成化学计量关系矩阵A中和这对辅助因子对应的行线性相关。解决这个问题的简单方法是在反应中只保留每对辅助因子中的一个，上述辅助因子通常保留NADH、NADPH和ATP。

（3）系统选择哪些胞外流量进行测定是不确定的，有些胞外流量组合会造成矩阵A₂奇异。发生这种情况的一个原因是某个质量平衡方程中的所有变量都被选择为测量数据，导致该平衡方程对未知流量没有限制作用而无法确定系统。对于大规模代谢网络，通常识别出导致矩阵奇异或非奇异的一组测量流量是较困难的，当矩阵奇异时，唯一可行的办法是更换一组胞外流量进行测量，并检测矩阵A₂是否非奇异。例如，在例5.2中，如果选择r_X和r_S作为测量的胞外流量，则按式（5-18）形式有：

可以明显看到矩阵A₂是一个奇异矩阵，因此无法求解。

如果选择r_X和r_L作为测量的胞外流量，则有：

则可按式（5-19）计算，得到胞内流量的结果为：

则其他未测量的胞外流量为：

从（d）计算结果可以看到，r_X和r_S成比例关系，即存在线性相关，因此在（a）中选择r_X和r_S作为被测量的胞外流量会造成矩阵A₂奇异。这个问题在进行代谢流分析计算之前很难直接识别，一般只有将被测量的胞外流量进行分组，通过分析不同组的矩阵才能确定哪些测量组合能够求出整个系统的流量。

2.超定系统

如果测量的胞外流量的个数大于系统的自由度F，则这种系统称为超定系统（overdetermined system）。如果按照式（5-16）将超定系统的化学计量关系矩阵 A进行分割，则矩阵A₂不是一个方阵，无法求逆矩阵。一种解决方法是将多出的测量流量（冗余流量）作为验证项，将系统转变为正定系统，计算得到胞内流量和其他胞外流量后，将验证项的测量值与计算值进行比较，检验数据的一致性。如果在实验误差允许的范围内，测量值与计算值的一致性很好，则表明代谢网络模型很好地描述了该实验条件下微生物的生理状态。另一种方法是使用统计学的方法从所有测量数据中获得流量 v的计算值，并对测量流量也获得新的计算值，这种方法获得的计算值与测量值的数据一致性一般都是较好的。计算的方法是对流量向量进行最小二乘法估计，即在式（5-18）两侧同时乘以矩阵A₂的转置矩阵，则有：

则是一个方阵，如果满秩，可以求逆，上式可变形为：

式（5-21）中，也称为A₂的拟-逆矩阵。需要注意的是，非奇异，方程才能求解。此外，超定系统的冗余度越大，也就是测量流量数目超出自由度的数目越多，则系统估计的计算值越可靠。

3.不定系统

对于较大的复杂代谢网络，可测量流量的个数小于系统的自由度F，或者无法列出足够的平衡方程，造成方程数少于未知流量数，这种系统称为不定系统（undetermined system）。对于不定系统，代谢流存在无数个解，对于这种情况，如果规定一个合适的目标函数，就能够利用线性规划来确定代谢流分布。基于线性规划的算法也称为流平衡分析（flux balance analysis，FBA），其基本的组成部分包括约束条件、决策变量和目标函数。在系统处于拟稳态的假设条件下，设置一定的约束条件和目标函数，来研究胞内的代谢流分布。其基本算法可由下式表示：

式中，A是系统的化学计量关系矩阵；v是系统中n个流量组成的列向量；α_i和β_i分别是流量v的上下限；Z是目标函数，它是流量向量中各元素的线性组合；c是目标函数中各流量系数组成的行向量。

目标函数可以是式（5-22）中的max（Z），如细胞的最大比生长速率或某种产物的最大得率；也可以是min（Z），如某种代谢副产物的最小得率。式（5-22）表示的优化过程，就是在v的解空间中依据目标函数得到最优解的过程。最优解可能是解空间中的某个极值或定点，此时可以得到唯一解，但最优解也可能是解空间中的一条线或面，此时得到的仍然是无数个解的集合，这种情况下可以在模型中引入反应的动力学或热力学参数作为额外的约束条件，进一步缩小解空间，以得到最优唯一解。流平衡分析过程一般需要利用MATLAB或Mathematica等数学软件来实现。

除了线性规划的方法外，还有两种重要的分析方法，基元模式分析（elementary mode analysis，EMA）和极端途径分析（extreme pathway analysis，EPA）。这些方法从代谢网络的拓扑结构入手，分析时不需要反应的动力学信息、拟稳态数据和设定目标函数，分析得到的结果是代谢网络中所包含的所有路径信息，这些路径信息可以反映拟稳态条件下该细胞所包含的所有代谢途径信息。

4.敏感性分析

使用上述方法进行计算时，必须分析化学计量关系矩阵对测量数据的敏感性，即检查矩阵是否是状态良好的（well-conditioned）。对一个病态（ill-conditioned）的矩阵，在矩阵运算时会将测量数据的微小扰动或误差放大，导致计算结果的严重错误。如下式中的化学计量关系矩阵：

两个方程的测量值（2，2）^T和（2，2.0001）^T仅相差一个很小的0.0001，但第一个方程的解为v₁=2和v₂=0，而第二个方程的解为v₁=v₂=1。示例中测量值的变化小于0.1%，却导致了流量计算值的显著变化，这意味着在实际实验中，即使很小的测量误差也会被病态矩阵放大，造成更大的偏差。一个矩阵敏感性的度量称为条件数，其计算方程为：

式中，‖ ‖表示矩阵的范数；（A^T）^#表示化学计量关系矩阵的拟-逆矩阵。

条件数的计算十分复杂，可以利用MATLAB或Mathematica等软件计算。式（5-23）中的矩阵条件数为10⁴，条件数有五位数字，就要求流量必须精确测量到五位数字，而发酵速率很少能精确到2位数字以上，因此一个较合理的化学计量关系矩阵的条件数应处于1～100之间，如果条件数大于100，则说明此化学计量关系矩阵是病态的。需要注意的是，在计算条件数时，不需要进行流量的测量，因此可以在代谢流计算之前注意化学计量关系矩阵是否病态。

下面尝试进行一个比例5.1和例5.2更复杂一点的代谢网络的代谢流分析。

例5.3 本章的第一节简单介绍了以大肠杆菌为代表的一些肠道细菌，能够利用葡萄糖进行混合酸发酵，同时生成甲酸、乙酸、乙醇、乳酸及琥珀酸等多种代谢产物。图5-20是一株经过代谢工程改造的产琥珀酸大肠杆菌的简化代谢网络。其中，回补途径只考虑反应4一个途径，或者说用v₄表示回补途径的总反应流量；乙醛酸途径在这株菌中也是激活的，将它与TCA循环中的部分反应简化合并为反应11；将可以进行简化的线性反应都进行了合并；不对ATP进行平衡计算，因此代谢网络中并未标出ATP的产生和消耗。假设在这株菌批式发酵的稳定期（比生长速率μ为0）测量得到了葡萄糖的比消耗速率为r_S=-2.13mmol/（g·h），以及产物的比生成速率，其中乳酸 v₁₃=0mmol/（g·h）、甲酸v₁₄=0.99mmol/（g·h）、乙酸 v₁₅=0.14mmol/（g·h）、乙醇 v₁₆=0mmol/（g·h）、琥珀酸 v₁₇=3.41mmol/（g·h）。

首先，将图5-20中的各步反应列出。

图5-20 大肠杆菌混合酸发酵代谢网络简图

AcA—乙酸 AcCoA—乙酰辅酶A AcP—乙酰磷酸 Eth—乙醇

FA—甲酸 G6P—6-磷酸葡萄糖 LA—乳酸 MalA—苹果酸

OAA—草酰乙酸 Pyr—丙酮酸 PEP—磷酸烯醇式丙酮酸 SucA—琥珀酸

不考虑葡萄糖磷酸转移酶系统（PTS），葡萄糖由己糖激酶运输并直接磷酸化：

（1）6-磷酸葡萄糖-葡萄糖=0

在稳定期比生长速率为0，生物量合成简化为只有葡萄糖-6-磷酸一种代谢物参与，实际上这步反应的流量为0：

（2）生物量-葡萄糖-6-磷酸=0

将EMP途径简化为一步反应：

（3）2丙酮酸+2 NADH-6-磷酸葡萄糖=0

①6-磷酸果糖-6-磷酸葡萄糖=0

②1，6-二磷酸果糖-6-磷酸果糖=0

③2×（3-磷酸甘油醛）-1，6-二磷酸果糖=0

④丙酮酸+NADH-3-磷酸甘油醛=0

回补途径用一个方程表示其总反应：

（4）草酰乙酸-丙酮酸-CO₂=0

乳酸代谢途径：

（5）乳酸-丙酮酸-NADH=0

甲酸代谢途径：

（6）甲酸+乙酰辅酶A-丙酮酸-辅酶A=0

（7）CO₂+H₂-甲酸=0

乙酸代谢途径简化为一步反应：

（8）乙酸+辅酶A-乙酰辅酶A=0

①乙酰磷酸+辅酶A-乙酰辅酶A=0

②乙酸-乙酰磷酸=0

乙醇代谢途径简化为一步反应：

（9）乙醇+辅酶A-乙酰辅酶A-2 NADH=0

①乙醛+辅酶A-乙酰辅酶A-NADH=0

②乙醇-乙醛-NADH=0

TCA循环部分反应和乙醛酸途径合并为一步反应：

（10）苹果酸+琥珀酸+2辅酶A-2乙酰辅酶A-草酰乙酸=0

①柠檬酸+辅酶A-乙酰辅酶A-草酰乙酸=0

②异柠檬酸-柠檬酸=0

③乙醛酸+琥珀酸-异柠檬酸=0

④苹果酸+辅酶A-乙醛酸-乙酰辅酶A=0

（11）苹果酸-草酰乙酸-NADH=0

（12）琥珀酸-苹果酸-NADH=0

①延胡索酸-苹果酸=0

②琥珀酸-延胡索酸-NADH=0

图中的流量（13）～（17）分别是乳酸、甲酸、乙酸、乙醇和琥珀酸的胞外流量，为已知的测量数据。

根据图5-20和其中的反应方程，可列出如下6种胞内代谢物的平衡方程。(www.daowen.com)

葡萄糖-6-磷酸：v₁-v₂-v₃=0

丙酮酸：2 v₃-v₄-v₆-v₅=0

乙酰辅酶A：v₆-v₈-v₉-2 v₁₀=0

草酰乙酸：v₄-v₁₀-v₁₁=0

苹果酸：v₁₀+v₁₁-v₁₂=0

NADH：2v₃-v₅-2v₉-v₁₁-v₁₂=0

7个胞外流量的平衡方程。

葡萄糖：r_S=-v₁

生物量：μ=v₂

乳酸：v₁₃=v₅

甲酸：v₁₄=v₆-v₇

乙酸：v₁₅=v₈

乙醇：v₁₆=v₉

琥珀酸：v₁₇=v₁₀+v₁₂

网络中共有19个流量，13个平衡方程，系统的自由度为6，测量数据为7个胞外流量r_S、μ、v₁₃、v₁₄、v₁₅、v₁₆、v₁₇，因此系统是超定系统。按式（5-18）的形式，则有测量的流量v_m和化学计量关系矩阵A₂如下，

计算矩阵A₂的拟-逆矩阵，得到的计算结果为：

则根据式（5-21），将测量的流量数值r_S、μ、v₁₃、v₁₄、v₁₅、v₁₆、v₁₇，代入，则可得：

（v₁ v₂ v₃ v₄ v₅ v₆ v₇ v₈ v₉ v₁₀ v₁₁ v₁₂）^T=

（2.14 -0.01 2.16 2.58 -0.01 1.76 0.77 0.14 -0.01 0.82 1.76 2.59）^T

向量v中的12个流量加上7个测量的胞外流量即为整个代谢网络中的19个流量。将所有的流量数值写入图5-20的对应途径中，就可以得到该菌批示发酵过程中稳定期的代谢流分布图。

将胞外流量的测量值与计算值进行比较，列入表5-6中。从计算结果可以看到，计算值和测量值间并不完全相等，在误差范围内一致性较好。而且还可以发现胞内流量的平衡也存在一定差值，如v₁、v₂、v₃应该存在v₁-v₂-v₃=0，而计算值为2.14 +0.01-2.16 =-0.01。其他分支途径也多少存在这样的细微差值。实际上，这正是前面所说的，超定系统采用的统计学方法，利用最小二乘法从所有测量数据中获得流量v的估计值，并对测量流量也获得新的估计值。这种算法与正定系统的求解多元一次方程组完全不同，正定系统是进行等式间的迭代计算，如果某个测量数据有误差，那么这种误差会通过等式传递到网络中，并且不会减小。而超定系统的最小二乘法估计，是在计算过程中就完成了计算值和测量值间的数据一致性检验，在一定程度上减小，或者说均化了测量数据可能存在的误差，而且冗余流量越多计算得到的数据越可靠。

表5-6 流量的测量值与计算值的比较

三、同位素标记实验测定代谢流简介

从前面的讨论中可以看出，代谢流分析的输入值主要是胞外代谢物的流量，即比底物消耗（吸收）速率和比产物生成（分泌）速率。但使用胞外代谢物的流量来确定代谢网络的流量，仅能提供代谢网络中少数分支点上碳流量分布的信息，网络的分辨率十分有限，对于阐明代谢网络的特征方面具有较大的局限性，例如，无法确定可逆反应、并行途径、竞争性途径以及循环途径的流量。举个简单例子，在图5-21中所示的代谢途径中，6-磷酸葡萄糖在两条竞争途径之间分流（v₁和v₂），并可形成循环途径“6-磷酸葡萄糖→6-磷酸葡萄酸→6磷酸果糖→6-磷酸葡萄糖”。如果利用6-磷酸葡萄糖的消耗速率以及产物甘油和乙酸的分泌速率作为系统的输入值，则只能确定分支点3-磷酸丙糖、丙酮酸以及下一步乙酰-CoA的流量分布，但是v₁和v₂却无法确定。同样，如果更多的竞争、分支或并行反应包含在6-磷酸果糖至3-磷酸丙糖的转化途径中，仅由胞外流量的数据也是无法确定的。因此，如果需要有关途径1和途径2的分配比的更多信息，或所述反应步骤的更高的分辨率，则必须采用其他测量方法以获取关于内部流量的额外信息。

图5-21 代谢网络流量分流示意

获取细胞内部流量信息的一种方法是同位素标记实验，通常在特定碳位用¹³C或¹⁴C标记化合物。通过使用这样的化合物，追踪碳原子在反应中的去向，可以获得比前述方法更多的平衡方程的数目，因此一般同位素标记实验可以建立一个超定系统。同时，由于有足够多的平衡方程，ATP和NADH这些代谢物的平衡方程就可以舍弃不用（这些代谢物涉及的反应纷繁复杂，有些情况下，其平衡方程不能保证完全正确），从而更准确地确定细胞内的代谢流分布。另外，通过不同途径生成的某种相同代谢物，得到的代谢物的标记模式可能不同，这样就有可能使用同位素标记的方法区分这些代谢途径，从而提高对生化反应网络的分辨率。通常可以使用气质联用（GC-MS）来测量代谢物不同标记模式的富集度信息，或者利用核磁共振（NMR）分析获得代谢物的精细结构信息，并用于后续的流量估计。这类方法无疑具有更高的准确性，但较高的实验费用也是其使用受到限制的重要因素。在进行同位素标记实验时需要注意几点：①拟稳态假设是MFA的重要前提，在同位素标记实验中，不仅要保证系统处于代谢稳定状态，而且还要使系统处于同位素平衡状态。②必须慎重选择标记底物的种类和标记模式，标记底物及标记模式的合理使用可以以较低的实验成本获得更多的胞内流量信息。③为降低实验中标记底物用量方面的费用，实验的培养体积应尽量小，但培养体积太小很难使系统达到稳定状态，一般培养液的体积在300～1000mL。④在处理样品方面，对不同代谢物应选择合适的处理方法，以保证化合物的结构不被破坏。

四、代谢流分析的应用实例

需要强调的是，不要把代谢流分析看成简单的矩阵变换，这个数学过程只是代谢流分析的计算手段。但正是这个矩阵建立的数学关系量化了整个代谢网络的生理状况。矩阵是整个代谢网络中代谢物之间的量化关系（化学计量关系），选择的代谢网络有一点改变，矩阵就会跟着变化。矩阵还是胞外胞内流量的量化关系，它连接了已知的输入流量向量和未知的胞内流量向量。由矩阵求解的流量则是所选条件下，胞内生理状况的量化结果，它为代谢工程的其他分析设计提供了必要的信息，主要有四点：①最大理论得率的计算。在复杂代谢网络中，通过代谢流分析可以获得更加正规可取的最大理论得率，为寻找最优控制策略提供一个基准，为优化发酵过程或进行基因改造提供有益参考。②识别途径中分支点的控制形式。通过比较不同培养条件下，或者不同变异菌株导致的，分支点的代谢流分配比的变化，可以对这些重要节点的刚性和柔性进行鉴别，从而找到对产物合成具有重要影响的关键分支点和关键酶。③未测量的胞外流量的计算。如利用化学计量关系模型和已知流量计算未知各种副产物的产生速率。④替代途径的识别。对于许多微生物来说，可能一些具体的反应途径并不清晰，那么通过代谢流分析能够识别不同条件下的替代途径。

下面以一个谷氨酸细菌生产赖基酸的例子对代谢流分析的应用进行讨论。

1.代谢网络的建立

赖氨酸是一种重要的氨基酸，一般被用作食品强化剂和饲料添加剂。在细菌中赖氨酸由草酰乙酸经天冬氨酸-β-半醛再经二氨基庚二酸合成。目前广泛采用的赖氨酸生产法是直接发酵法，通常以甘蔗或甜菜制糖后的废糖蜜、淀粉水解液等廉价糖质原料利用微生物进行发酵。用于生产赖氨酸的主要微生物有谷氨酸棒状杆菌（Corynebacteriumglutamicum）、黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）、乳糖发酵短杆菌（Brevibacteriumlactofermentum）的突变株等，这些微生物一般被称为谷氨酸细菌。下面对一株谷氨酸棒状杆菌进行代谢流分析，以了解代谢流分析的一般方法及其应用。

首先，选择一个合适的代谢网络是至关重要的。微生物细胞内的生化反应有成千上万个，代谢网络极其庞大，全部都予以考虑显然是不现实的，而且也没有必要。因此，首先应对代谢途径进行取舍，构建一个简化而且合理的代谢网络。选择的代谢途径不能过多，否则可能会产生太多的未知量，使分析结果难以确定；同时代谢网络也不能过于简单。与实际情况差别较大，不能真实反映出胞内的代谢流分布，则失去代谢流分析的意义。例如，在前文例5.1和例5.2中使用的代谢网络就十分简单，显然不能真实反映胞内的情形，当然它们的作用主要是为了简单示范代谢流分析的基本原理。

在建立一个碳源代谢网络时，一方面要尽可能涵盖主要的生化反应，尤其涉及胞外流量（底物吸收和产物分泌）、辅助因子（NADH、NADPH、FADH等）以及与能量代谢偶联（产生或消耗ATP）的途径；另一方面要简化途径。合理地简化线性途径，对复杂的分支途径要以实验数据为依据进行取舍。检测途径的酶活力是一个有效的决定途径取舍的方法。同时，还应注意在计算过程中可能出现的化学计量关系矩阵为奇异矩阵的情况。首先，建立谷氨酸棒状杆菌代谢网络，并将网络作图，如图5-22所示。

葡萄糖进入细胞有两种反应，葡萄糖转移酶（PTS）系统和己糖激酶（GK）反应。对于细菌来说，主要采用葡萄糖转移酶系统。如果按己糖激酶反应（1b）计算，则会由于其中没有磷酸烯醇式丙酮酸的消耗，而使这两个途径的代谢流分析的结果有较大区别。对于此网络中的反应，选择磷酸转移酶系统（1a）。

（1）葡萄糖转移酶系统

6-磷酸葡萄糖+丙酮酸-葡萄糖-磷酸烯醇式丙酮酸=0

储存化合物海藻糖的合成由海藻糖磷酸合成酶（TPS）催化，它催化葡萄糖从UDP-葡萄糖转移到葡萄糖-6-磷酸生成海藻糖-6-磷酸和UDP，其总反应方程式如下。

（2）海藻糖磷酸合成酶

0.5海藻糖+0.5 ADP-葡萄糖-6-磷酸-0.5 ATP=0

对EMP途径中的部分线性途径进行简化；但要注意，多条途径分支点处的代谢物通常不能删除，分支点的代谢流分布是描述网络代谢流向的重要依据。其中，6-磷酸葡萄糖、3-磷酸甘油醛、3-磷酸甘油酸、磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸作为参与生物量合成的前体代谢物：

（3）磷酸己糖异构酶（GPI）：6-磷酸果糖-6-磷酸葡萄糖=0；

（4）磷酸果糖激酶（PFK1）和磷酸甘油醛异构酶（TPI）：2×3-磷酸甘油醛+ADP-6-磷酸果糖-ATP=0；

（5）甘油醛磷酸脱氢酶（GAPDH）和磷酸甘油酸激酶（PGK）：3-磷酸甘油酸+ATP+NADH-甘油醛-3-磷酸-ADP-NAD=0；

（6）磷酸甘油酸变位酶（PGM）和烯醇化酶（ENO）：磷酸烯醇式丙酮酸+H₂O-3-磷酸甘油酸=0；

（7）丙酮酸激酶（PK）：丙酮酸+ATP-磷酸烯醇式丙酮酸-ADP=0。

谷氨酸棒状杆菌在供氧不足时，会产生代谢副产物乳酸。

（8）乳酸脱氢酶：乳酸+NAD-丙酮酸-NADH=0。

图5-22 谷氨酸细菌的代谢网络

代谢中间体的缩写：α-KG—α-酮戊二酸 3PG—3-磷酸甘油酸 AcCoA—乙酰-CoA AcA—乙酸

Asp—天冬氨酸 Lys—赖氨酸 E4P—4-磷酸赤藓糖 F6P—6-磷酸果糖 G3P—3-磷酸甘油醛

G6P—6-磷酸葡萄糖 Gln—谷氨酰胺 Glu—谷氨酸 IsoCit—异柠檬酸 MalA—苹果酸 OAA—草酰乙酸

PEP—磷酸烯醇式丙酮酸 Pyr—丙酮酸 Rib5P—5-磷酸核糖 Ribu5P—5-磷酸核酮糖

Sed7P—7-磷酸景天庚酮糖 SucA—琥珀酸 Suc-CoA—琥珀酰 CoA Xyl5P—5-磷酸木酮糖

（9）草酰乙酸是天冬氨酸合成的前体代谢物，回补途径主要集中于此，包括了PEP羧化酶（PEPC）反应、丙酮酸羧化酶（PC）、异柠檬酸裂解酶（ICL）和苹果酸合酶（MS）、苹果酸脱氢酶（MDH）、草酰乙酸脱羧酶（OAADC）以及PEP羧激酶（PEPCK）等反应。此网络中，反应（9）用PEP羧化酶反应（9a）代表回补途径所有反应（9a～9f）的总反应式。

①PEP羧化酶：草酰乙酸-磷酸烯醇式丙酮酸-CO₂=0；

②丙酮酸羧化酶：草酰乙酸+ADP-丙酮酸-ATP-CO₂=0；

③PEP羧激酶：磷酸烯醇式丙酮酸+GDP+CO₂-草酰乙酸-GTP=0；

④草酰乙酸脱羧酶：丙酮酸+CO₂-草酰乙酸=0；

⑤异柠檬酸裂解酶和苹果酸合酶（乙醛酸途径）：苹果酸+辅酶A +琥珀酸-异柠檬酸-乙酰辅酶A=0；

⑥苹果酸脱氢酶：（TCA循环的最后一个酶，即反应16）。

对TCA循环的部分线性途径进行简化。其中乙酰辅酶A、草酰乙酸和α-酮戊二酸作为参与生物量合成的前体代谢物：

（10）丙酮酸脱氢酶复合体：（PDH）乙酰辅酶A +NADH +CO₂-丙酮酸-辅酶A-NAD=0；

（11）柠檬酸合酶（CS）和顺乌头酸酶（ACO）：异柠檬酸+辅酶A-乙酰辅酶A-草酰乙酸-H₂O=0；

（12）异柠檬酸脱氢酶（IDH）：α-酮戊二酸+NADPH+CO₂-异柠檬酸-NADP=0；

（13）α-酮戊二酸脱氢酶（KGDH）：琥珀酰辅酶A +NADH +CO₂-α-酮戊二酸-辅酶A-NAD=0；

（14）琥珀酰辅酶A合成酶（SCS）：琥珀酸+辅酶A+ATP-琥珀酰辅酶A-ADP=0；

（15）琥珀酸脱氢酶（SDH）和延胡索酸酶（FUM）：苹果酸+FADH-琥珀酸-H₂O-FAD=0；

（16）苹果酸脱氢酶：草酰乙酸+NADH-苹果酸-NAD=0。

（17）乙酰辅酶A合成酶被乙酸诱导受葡萄糖效应阻遏，因此它在以乙酸为底物时才有活性。此网络以葡萄糖为底物，因此反应（17）为副产物乙酸的生成途径（17a）：

①乙酸磷酸转移酶和乙酸激酶：乙酸+辅酶A+ATP-乙酰辅酶A-ADP=0；

②乙酰辅酶A合成酶：乙酰辅酶A+H₂O+ADP-乙酸-辅酶A-ATP=0。

此网络选择谷氨酸合成途径作为氨吸收的主要途径，并且认为谷氨酸是氨基的“中转站”，以简化氨基酸合成途径。对于这样的选择可以通过检测谷氨酸脱氢酶、天冬氨酸酶、丙氨酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶以及转氨酶的活性确定。由于发酵过程中，铵离子浓度较高，因此谷氨酰胺合成酶-谷氨酸合成酶途径（GS-GOGAT途径）不活跃（18b），反应（18）选择谷氨酸脱氢酸途径（18a）。其他非产物氨基酸的合成主要用于细胞生物量的合成。在生物量合成方程中都被换算为其前体代谢物的量，因此它们的合成途径省略。

（18）谷氨酸脱氢酶（GDH）：谷氨酸+H₂O+NADP-NH₃-α-酮戊二酸-NADPH=0。

天冬氨酸族氨基酸的合成。根据上述反应18的假设，反应（19）天冬氨酸由天冬氨酸氨基转移酶催化合成。赖氨酸由天冬氨酸经9步反应合成，反应式（20）为总反应方程式。

（19）天冬氨酸氨基转移酶：天冬氨酸+α-酮戊二酸-草酰乙酸-谷氨酸=0；赖氨酸由天冬氨酸经9步反应合成，反应式（20）为总反应方程式。

（20）赖氨酸合成总方程式：琥珀酸+α-酮戊二酸+赖氨酸+2 NADP+辅酶A+CO₂+ADP-天冬氨酸-丙酮酸-2 NADPH-琥珀酰辅酶A-谷氨酸-ATP=0。

（21）赖氨酸分泌至胞外：赖氨酸-E-赖氨酸=0。

PP途径是网络中主要的NADPH供给源。其中核糖-5-磷酸和赤藓糖-4-磷酸作为参与生物量合成的前体代谢物。

（22）6-磷酸葡萄糖脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶：5-磷酸核酮糖+CO₂+2 NADPH-6-磷酸葡萄糖-H₂O-2 NADP=0；

（23）磷酸戊糖异构酶：5-磷酸核糖-5-磷酸核酮糖=0；

（24）磷酸戊糖差向异构酶：5-磷酸木酮糖-5-磷酸核酮糖=0；

（25）转酮醇酶：7-磷酸景天庚酮糖+3-磷酸甘油醛-5-磷酸木酮糖-5-磷酸核糖=0；

（26）转醛醇酶：6-磷酸果糖+4-磷酸赤藓糖-7-磷酸景天庚酮糖-3-磷酸甘油醛=0；

（27）转酮醇酶：6-磷酸果糖+3-磷酸甘油醛-5-磷酸木酮糖-4-磷酸赤藓糖=0。

对原核生物而言，氧化磷酸化的理论化学计量关系（P/O）=2。

（28）2H₂O+4 ATP+2 NAD-2 NADH-O₂-4 ADP=0；

（29）2H₂O+2 ATP+2 FAD-2 FADH-O₂-2 ADP=0。

由于涉及能量产生与消耗的过程比较复杂，很难完全衡算，因此误差较大。在条件允许的情况下，能量平衡方程不用于代谢流的计算，反应（30）为ATP的耗能反应，用来估计发酵过程中，考察能量是否过量或者不足。

（30）ADP+P_i-ATP=0。

生物量的合成反应，通常需要经过组分分析和元素实验确定。同时对于研究较详尽的一些菌株，如大肠杆菌、酵母菌及谷氨酸细菌，也可以通过查阅文献资料获得一些信息。例如，参考Joseph Vallino（1993）的研究中使用的谷氨酸棒状杆菌生物量合成方程，并将其根据表5-4简化成只与10种前体物质相关的方程式作为反应（31）。对于从文献参考的方程或者是组分分析数据等，是否适合个人的研究菌株，可以通过实验进行验证，如果差别较大则需要一定的修正。

（31）生物量+0.355 NADH+0.29 CO₂-0.028葡萄糖-6-磷酸-0.09核糖-5-磷酸-0.036赤藓糖-4-磷酸-0.013甘油醛-3-磷酸-0.15×3-磷酸甘油酸-0.052磷酸烯醇式丙酮酸-0.283丙酮酸-0.375乙酰辅酶A-0.107 α-酮戊二酸-0.18草酰乙酸-4.153 ATP-1.655 NADPH=0。

在整个网络中涉及的主要代谢物有34种，即3PG（3-磷酸甘油酸）、α-KG（α-酮戊二酸）、AcA（乙酸）、AcCoA（乙酰辅酶A）、Asp（天冬氨酸）、ATP（5′-三磷酸腺苷）、Biomass（生物量）、CO₂（二氧化碳）、E4P（4-磷酸赤藓糖）、FADH（还原型黄素腺嘌呤二核苷酸）、F6 P（6-磷酸果糖）、G3 P（3-磷酸甘油醛）、Glucose（葡萄糖）、G6 P（6-磷酸葡萄糖）、Glu（谷氨酸）、IsoCit（异柠檬酸）、LA（乳酸）、Lys（赖氨酸）、Lys-E [赖氨酸（胞外）]、MalA（苹果酸）、NADH（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）、NADPH（还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）、NH₃（氨）、O₂（氧）、OAA（草酰乙酸）、PEP（磷酸烯醇式丙酮酸）、Pyr（丙酮酸）、Rib5 P（5-磷酸核糖）、Ribu5 P（5-磷酸核酮糖）、Sed7 P（景天庚酮糖-7-磷酸）、SucA（琥珀酸）、SucCoA（琥珀酰辅酶A）、Trehal（海藻糖）和Xyl5 P（5-磷酸木酮糖）。

2.计算赖氨酸理论得率

产物理论得率可以由三种方式计算得到：根据底物转化为产物的总反应式计算、根据辅助因子平衡式计算和根据代谢网络的代谢流分析来计算；而且三种方法计算的结果应该是一致的。

（1）利用总反应式计算产物理论得率 这是一种利用黑箱模型计算的方法。把细胞看作一个黑箱，不管其内部发生了什么反应，只考虑在某个时刻测量进入黑箱的输入代谢物（底物）和输出代谢物（产物）的量（如速率），这样就得到了一个表示在该时刻输出代谢物经过细胞生成输出代谢物的总反应方程式，即黑箱模型。实际上，代谢流分析是黑箱模型的进一步演化，当黑箱内部的反应能被代谢网络及其化学计量关系描述时，得到的计算模型就成为了代谢流分析所研究的系统。

先列出葡萄糖转化为赖氨酸的总反应方程式：

与辅助因子平衡式的区别是，总反应方程没有考虑辅助因子。假设赖氨酸合成的过程中没有C、H、O、N的限制，那么式（5-25）中的5个化学计量系数可以根据元素平衡，得到：

都写成由e描述的计算式，可得到：

因此赖氨酸对底物葡萄糖的得率等于Y_L/G=6/（4 +e）。其中反应物氧气的化学计量系数不能为正值（即不会产生氧气），因此，e-3≥0，即e≥3。当 e =3时，赖氨酸有最大摩尔得率 Y_L/G=6/7 =0.857mol赖氨酸/mol葡萄糖。

（2）利用辅助因子平衡计算产物理论得率 如果将辅助因子NADH和NADPH考虑进来，首先需要列出赖氨酸代谢途径涉及的辅助因子的化学计量方程。只需要一条从底物葡萄糖至产物赖氨酸的主途径即可。选择的途径是从EMP途径经回补途径至赖氨酸合成，反应方程如下：

①赖氨酸合成反应为：

②天冬氨酸来自转氨酶反应：

③丙酮酸和磷酸烯醇式丙酮酸来自EMP途径：

④草酰乙酸来自回补途径：

⑤谷氨酸合成途径为：

⑥NADPH主要由PP途径供给：

将式（5-27）、式（5-28）、式（5-29）、式（5-30）、式（5-31）相加，再加上式（5-32）乘以2，可以得到赖氨酸的总反应方程式：

这里需要注意，如果考虑存在转氢酶（THD）活性，即可认为NADH和NADPH等效，那么式（5-34）需要2NADPH参与反应，也就是需要1/6×6-磷酸葡萄糖通过PP途径来提供这2NADPH，因此式（5-34）加上式（5-33）乘以1/6，可得到：

如果不存在转氢酶活力，则需要4NADPH，同样的道理，式（5-34）加上式（5-33）乘以1/3，可得到：

使用总反应方程计算时，采用了黑箱模型，并没有考虑黑箱内部的构造。而使用辅助因子平衡计算时，首先列出了一条连接葡萄糖和赖氨酸的反应途径，这实际上就是对黑箱内部的构造进行了一定程度的描述。因此，比黑箱模型更进一步，通过辅助因子平衡计算得到的结果“更有道理”。而利用代谢流分析去计算产物得率时，则是首先解析了黑箱内部的详细结构，因此获得的结果“最清晰明了，最有道理”，对代谢工程也更具有指导意义。或者可以这样认为，黑箱模型是只有一个代谢反应的“极简”代谢流分析，辅助因子平衡则是一条主要途径所有代谢反应的“简单”代谢流分析。但无论如何，其结果都是从同样的输入值和输出值计算得到的，因此其衡算结果应当是一致的。

如果不考虑葡萄糖磷酸转移酶系统（PTS），假设葡萄糖由己糖激酶运输并直接磷酸化，即，6-磷酸葡萄糖-葡萄糖=0，则由式（5-35）和式（5-36）可以得到赖氨酸摩尔得率分别为Y_L/G=6/7=0.857mol赖氨酸/mol葡萄糖和3/4=0.75mol赖氨酸/mol葡萄糖。可以看出，这两个结果分别是反应式（5-26）在e=3或e=4时得到的产物得率计算结果。

如果考虑葡萄糖由葡萄糖磷酸转移酶系统运输，每运输1mol葡萄糖进入细胞，需要消耗1mol PEP，并释放1mol丙酮酸，即

此时运输葡萄糖时释放的丙酮酸即可满足赖氨酸合成，因此赖氨酸合成的总反应式（5-34）需要减掉式（5-30），即此时EMP途径中磷酸烯醇式丙酮酸无需转化为丙酮酸，则有：

当不考虑转氢酶活力时，将式（5-29）乘以1/3，式（5-33）乘以1/3，式（5-37）乘以5/3后相加，再加上赖氨酸总反应式（5-38），可以得到：

由式（5-39）可得到赖氨酸摩尔得率为Y_L/G=3/5 =0.60mol赖氨酸/mol葡萄糖。同样的道理，如果存在转氢酶活力，则赖氨酸摩尔得率为Y_L/G=3/4 =0.75mol赖氨酸/mol葡萄糖。可以看出，这两个结果分别是反应式（5-26）在e=6和e =4时得到的产物得率计算结果。注意到，式（5-26）在e=6时合成1mol赖氨酸有4mol CO₂产生，但式（5-39）中只有2mol CO₂产生，这是由于这2mol CO₂在式（5-39）中以2/3mol丙酮酸的形式存在。如果不存在丙酮酸羧化酶，那么除用于合成赖氨酸所需的丙酮酸外，其余2/3mol丙酮酸都会在TCA循环中进一步被氧化，则会有2mol CO₂产生。

如果考虑此时存在丙酮酸羧化酶活力，那么式（5-39）中剩余的丙酮酸可以在丙酮酸羧化酶回补途径中进一步羧化生成草酰乙酸，则可增加赖氨酸的得率。但同时需要的NADPH的量也增加，也就是进入PP途径的葡萄糖的量也会增加，则通过葡萄糖磷酸转移酶系统运输的葡萄糖也会增加，继而剩余的丙酮酸又有增加，如此下来计算会进入循环，将变得十分复杂。因此通过辅助因子平衡计算理论得率的方法在某些简单情况下比较方便，也能提供简单的代谢反应信息。但当考虑的途径复杂化时，就需要借助代谢流分析的方法进行计算了。

（3）利用代谢流分析计算产物理论得率 前面两种方法的正确性不可否认，但它们所能提供的胞内代谢反应信息也十分有限。而通过代谢流分析不仅能获得产物的理论得率，还能量化底物进入细胞后在代谢网络中的代谢流分布，为进一步的代谢工程研究提供了详尽的胞内代谢反应信息。

当计算理论得率时，为了保证最大的产物得率，大部分流量值会被加以限定，从而获得能得到最大产物得率并且使所有的代谢物平衡的理论流量分布，也就是在合理的代谢流分布解空间内，搜索产物得率最大时的解。在赖氨酸最大理论得率计算中，理论上只有底物全部用于产物合成才能获得最大得率，因此需要设定生物量合成速率为0，除了赖氨酸之外的其他分泌产物乙酸、乳酸和海藻糖的流量也为0，葡萄糖吸收速率设定为-100，赖氨酸合成速率为得率Y。这样的计算结果也必然高于实际发酵过程所能能达到的最大得率，因为这里没有考虑细胞维持的消耗，仅是理论上所能达到的得率，但它是一个优化发酵过程的指导方向。

对于图5-22的代谢网络，可以直接进行分析计算，共有34个流量，可以列出34个平衡方程。但根据以上的限定条件，解出的很多流量是0。这里可以先做一点简化（图5-23），把设定流量为0的途径（虚线表示）忽略，简化代谢网络。在此代谢网络中，可以列出如下平衡方程：

葡萄糖：v₁=100

6-磷酸葡萄糖：v₁-v₃-v₂₂=0

6-磷酸果糖：v₃-v₄+v₂₆+v₂₇=0

3-磷酸甘油醛：2 v₄-v₅+v₂₅-v₂₆+v₂₇=0

3-磷酸甘油酸：v₅-v₆=0

磷酸烯醇式丙酮酸：v₆-v₇-v₉-v₁=0

丙酮酸：v₁+v₇-v₁₀-v₂₀=0

草酰乙酸：v₉+v₁₆-v₁₁-v₁₉=0

乙酰辅酶A：v₁₀-v₁₁=0

图5-23 赖氨酸理论得率为64%时的代谢流分布

海藻糖的缩写为Trehal，其他代谢中间体的缩写同图5-22

异柠檬酸：v₁₁-v₁₂=0

α-酮戊二酸：v₁₂-v₁₃-v₁₈+v₁₉+v₂₀=0

琥珀酰辅酶A：v₁₃-v₁₄-v₂₀=0

琥珀酸：v₁₄-v₁₅+v₂₀=0

苹果酸：v₁₅-v₁₆=0

谷氨酸：v₁₈-v₂₀-v₁₉=0

5-磷酸核酮糖：v₂₂-v₂₃-v₂₄=0

5-磷酸核糖：v₂₃-v₂₅=0

5-磷酸木酮糖：v₂₄-v₂₅-v₂₇=0

7-磷酸景天庚酮糖：v₂₅-v₂₆=0

4-磷酸赤藓糖：v₂₆-v₂₇=0

天冬氨酸：v₁₉-v₂₀=0

赖氨酸：v₂₀-v₂₁=0

赖氨酸-E：v₂₁=Y

NADPH：v₁₂+2v₂₂-v₁₈-2v₂₀=0（不考虑THD活性）

另外还有以下平衡方程（不用于代谢流确定）可以用来求解v₂₈、v₂₉和v₃₀的流量：

NADH（）：v₅+v₁₀+v₁₃+v₁₆-2v₂₈=0

FADH：v₁₅-2v₂₉=0

ATP：v₅-v₄+v₇+v₁₄+4v₂₈+2v₂₉-v₂₀-v₃₀=0

共有24个代谢物平衡方程，其中有24个流量，即可计算出整个网络的流量分布。计算过程见式（5-40）和式（5-41）。在式（5-41）中，不断增大赖氨酸流量Y，直至出现不可能的流量分布为止，即可得到流量分布上合理的产物得率最大值。如果不考虑丙酮酸羧化酶活力，则当赖氨酸流量接近60%左右时，此时丙酮酸激酶流量（v₇）达到0，出现第一个不可能流量分布临界点（图5-23）。因为葡萄糖运输使用PTS系统，因此v₇最低限的流量为0。如果将PEP合成酶或者丙酮酸羧化酶加入到代谢网络中，则可继续增加赖氨酸的产量。当赖氨酸流量达到75%时，会出现第二个不可能流量分布临界点（图5-24）。此时TCA循环流量为0；如果再继续增大赖氨酸流量，TCA循环流量将成为负值。如果考虑THD活性使NADPH和NADH等价，采用类似的计算方法，将会计算得出赖氨酸的最大理论得率分别为75%（无丙酮酸羧化酶活力）或85.7%（有丙酮酸羧化酶活力）。可以看到，利用代谢流分析得到的理论得率与前述辅助因子平衡计算法的结果一致。

需要注意的是，这些代谢流分析的结果是基于图5-23和图5-24所设计的代谢网络得到的。如果代谢网络中的途径发生变化，则整个代谢流分布就会随之改变。因此，获得准确且合理的代谢流分析结果的重要前提条件，就是要设计一个合理的简化的代谢网络。例如，图5-25描述的赖氨酸得率为35%时的两个网络（数据来自Vallino，1993），其中B网络中用乙醛酸循环和草酰乙酸脱羧酶的回补途径取代了A网络中的PEP羧化酶反应，同时移除了α-酮戊二酸脱氢酶。虽然两个网络赖氨酸的得率均为35%，但由于反应网络的轻微改变，造成其代谢流分布的显著差异。

图5-24 赖氨酸理论得率为75%时的代谢流分布

代谢中间体的缩写同图5-22

图5-25 不同代谢网络中赖氨酸得率为35%的理论代谢流分布（Vallino，1993）

代谢中间体缩写同图5-22

进行理论流量计算后，可以计算二氧化碳释放速率和氧气吸收速率，进而可以确定呼吸商（RQ）的理论值。在最大理论得率为75%时，计算的理论RQ值为2.0。此数值可以用来按照其接近理论最大值的程度对发酵过程进行基准标定，也可用于生物反应器流加策略的设计以及寻找最优操作点。同样的道理，如果设定赖氨酸的生产速率为0，也可以计算理论最大生物量得率。重复前面的计算过程，可以得到理论最大生物量得率为75%。但是这个结果是偏高的，它并没有考虑细胞维持需要和无效循环。

3.代谢网络节点类型的识别

在细胞的代谢网络中，两个或多个不同途径的分支汇合点称为节点（node）。根据节点对代谢调节的敏感度，可将节点分为柔性节点、弱刚性节点和强刚性节点三类。

（1）柔性节点（flexible node）柔性节点处流量分配比容易改变，对代谢调节不敏感；或者说其流量分配比受代谢调节的控制较弱，仅取决于细胞对其分支途径代谢物的需求，各分支途径的酶通常具有类似的底物亲和力以及类似的反应速率。因此，柔性节点不会限制途径产物的得率，无论何时只要有需要，任何分支都可以得到100%的分配比。

（2）弱刚性节点（weakly rigid node）此类节点对代谢调节适度敏感，其流量分配比由一个支路控制，因此这条分支途径比其他分支途径呈现显著优势。这是弱刚性节点与柔性节点的区别。其原因是该支路的酶对共同代谢物具有更高的活性和（或）底物亲和力。

（3）强刚性节点（strongly rigid node）此类节点对代谢调节高度敏感，其流量分配比在一个或多个支路上严格受到途径产物的代谢调控（激活或抑制）。一个分支途径的产物代谢物是其自己形成的抑制剂，同时又是其他竞争分支途径的激活剂。因此，刚性节点对分支途径产物得率具有控制性的影响。它对分支途径的活性不敏感，仅增强产物途径活性，不会提高产物得率。

分析赖氨酸代谢网络的代谢流，焦点在于提高赖氨酸得率。产物得率可以通过增强产物途径中的酶活力来提高，这种提高实际上是该途径在节点获得了更多的流量分配引起的。其原因在于，产物的得率是节点流量分配比的函数，最终决定产物得率的因素是节点流量的分配比。在代谢工程研究领域中，焦点之一就是把改变节点分配比作为提高产物得率（降低副产物得率）的主要机制。一个代谢网络中存在着大量的节点。一般情况下，只有相当少的节点处的流量分配比影响产物（或副产物）得率，这些节点称为主节点（major node）。代谢流分析的第一个关键问题是识别代谢网络中那些对产物合成或导致副产物生成起决定作用的主节点。虽然代谢网络中包含大量节点，但当产物（或副产物）得率改变时，只有几个节点的流量分配比实际上发生改变，其余节点的分配比相对不受影响。通过类似于前述理论得率计算的方法进行代谢流分析，观察产物得率和不同节点的流量分配比的变化，可以识别出主节点。

当赖氨酸得率升高时，有五个分支节点，即6-磷酸葡萄糖、6-磷酸果糖、磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）、丙酮酸和草酰乙酸的分配比受到明显影响。其中只有两个分支点，即6-磷酸葡萄糖和PEP/Pyr组由于下列原因而被认为是有兴趣的主节点。当赖氨酸得率小于60%时，6-磷酸果糖处的流量分布表现为一个汇合点；而当赖氨酸得率高于60%时，6-磷酸果糖则是一个分支点。在后一种情况中，异构酶反应逆转，而6-磷酸葡萄糖变成一个汇合点。因此在6-磷酸葡萄糖和6-磷酸果糖之间，其中一个总是分支点，而另一个则是汇合点。由于在实际发酵过程中，一般得率总是低于60%，因此，在代谢分析中仅把6-磷酸葡萄糖考虑为一个主分支点。就草酰乙酸来说，对该节点的仔细研究表明，由于所有被柠檬酸合酶消耗的草酰乙酸必须通过苹果酸脱氢酶返回（TCA循环最后一个酶），所以它基本上是不重要的。本质上，TCA循环流量仅仅通过草酰乙酸节点。结果，用于赖氨酸合成所消耗的全部草酰乙酸是由回补途径产生的。这就强调了理解TCA循环及有关回补途径中质量平衡限制的重要性。应注意的是，所有经乙酰-CoA进入TCA循环的碳必须被氧化为CO₂，而通过其他反应进入TCA循环的碳不能被氧化，而且最终必须离开循环以便为生物质及产物合成提供前体。鉴于对这些概念的误解，已建议通过直接接入富马酸（延胡索酸），天冬氨酸酶会提高天冬氨酸的利用率。然而，富马酸并不比草酰乙酸可利用性高，因为它们任何一个的净产量都受回补途径流量的支配。这一点已被引入天冬氨酸酶活力试图提高赖氨酸得率而失败的事实所证实。由于缺乏PEP羧化酶和丙酮酸羧化酶这两个回补反应对赖氨酸合成贡献的信息，区别这两个羧化反应是不可能的，因此将二者组合在一起。丙酮酸代表一个重要的分支点，除了回补反应外，在赖氨酸合成途径中，它在二氢吡啶二羧酸合成酶反应中与天冬氨酸半醛进行缩合。此外，它可以在丙酮酸脱氢酶复合体（PDC）反应中形成乙酰辅酶A，并在TCA循环中进一步被氧化。

上述主节点，6-磷酸葡萄糖和PEP/Pyr组，简单地反映了这样一个事实：赖氨酸合成所需的四个前体（碳、NADPH、ATP及氨）中，两个（C和NADPH）依赖于葡萄糖供给，并因此依赖于上述分支点的代谢流量分布。其余两个前体（ATP和氨）显然不存在任何限制。这是由于伴随产生碳前体的葡萄糖分解代谢的反应可产生足够的ATP，而且为了氨基酸和赖氨酸生物合成的氮吸收反应是通过谷氨酰胺合成酶和谷氨酸脱氢酶同化系统充足提供的。如果研究的系统并不是这样，那么提供ATP和补充谷氨酸用于氨同化途径的反应，也应包含在赖氨酸生物合成网络的主分支点清单中。

总结一下赖氨酸得率对两个主节点分配比的依赖性，注意到当赖氨酸得率提高时，必须有较高比例的葡萄糖转入PP途径，以满足不断增长的NADPH需求。如果该节点的实际酶动力学是E MP途径对6-磷酸葡萄糖的争夺超过PP途径这种情况，那么，赖氨酸将是NADPH限制的，而且进入糖酵解的过量碳最终会导致副产物产生。然而，如果6-磷酸葡萄糖节点分配比是柔性的而且容易改变，以致准确满足NADPH需求，则赖氨酸得率限制由PEP/Pyr主节点的次优分配所引起。如果PEP/Pyr支路的回补途径分配比小于50%，则将合成不充足的草酰乙酸，且产生过量的丙酮酸，其很可能在TCA循环中被氧化。如果回补支路分配比大于50%，则将合成过量的草酰乙酸，其可能导致天冬氨酸或谷氨酸分泌。在6-磷酸葡萄糖和PEP/Pyr节点，最优的分配将导致最优的赖氨酸合成和理论产物得率，这是否可行取决于影响上述分支点分配比的酶反应的动力学和调控。

对于6-磷酸葡萄糖分支点的类型，Vallino和Stephanopoulos进行了扰动实验并进行代谢流分析：（a）减弱糖酵解第一个酶活力，即磷酸葡萄糖异构酶（GPI），试图使代谢流改向进入戊糖磷酸途径；（b）在发酵过程中使用葡萄糖酸盐作为唯一碳源，直接进入戊糖磷酸途径，有效绕过6-磷酸葡萄糖分支点。其实验结果证实了6-磷酸葡萄糖分支点的柔性，戊糖磷酸途径具有为满足赖氨酸生物合成需求而进行自我调节的能力，容易满足对产物和生物量合成的NADPH需求变化。而PEP/Pyr分支点如果是弱刚性的，由于丙酮酸脱氢酶对丙酮酸的亲和性比PEP和Pyr羧化酶要高得多，碳流会优先进入TCA循环。这种情况下，TCA循环流量相对不受赖氨酸途径中流量变化的影响，而产物得率受丙酮酸可利用性的限制。如果赖氨酸得率受到弱刚性节点的损害，那么丙酮酸脱氢酶的减弱应增大丙酮酸的可利用性，从而提高赖氨酸的得率，而如果赖氨酸得率低是由于PEP/Pyr分支点的强刚性或回补途径活性低，那么丙酮酸脱氢酶的减弱应导致某些中间代谢产物的分泌或者总网络流量降低。

通过扰动实验：①丙酮酸脱氢酶减弱突变株的发酵和代谢流分析，②在赖氨酸过量合成开始之后加入抑制剂氟丙酮酸，抑制丙酮酸脱氢酶活力，分析PEP/Pyr分支点的流量变化。实验结果得出的结论是，赖氨酸得率不受在TCA循环中丙酮酸优先消耗所限制，因此PEP/Pyr节点不是弱刚性的。赖氨酸合成或受强刚性PEP/Pyr节点限制，或受回补反应的低活性限制。要提高赖氨酸得率，应集中解除PEP/Pyr节点一些反应（丙酮酸脱氢酶、丙酮酸羧化酶、PEP羧化酶）的调节，或试图提高回补途径的流量，最可能的是催化丙酮酸羧化的反应。

本小节主要介绍了进行代谢流分析在理论得率和节点识别的应用。如果要进行在特定比生长速率下稳定生长时的代谢流分析，其计算方法与前述类似；只是在计算最大理论得率时被限定为0流量的途径不能够再取0，因此不能简化，需要在平衡方程中体现。反应（2）海藻糖、反应（8）乳酸、反应（17）乙酸以及反应（21）赖氨酸的比产生速率可以通过实验测定，反应（31）生物量合成的流量等于比生长速率。这些数据结合代谢网络的化学计量关系模型，即可计算出在特定比生长速率下稳定生长时胞内的代谢流，以用于各种情况的细胞代谢流分析。