霉菌是丝状真菌的统称，泛指那些能形成分枝繁茂的菌丝体，但又不产生像蘑菇那样的大型子实体真菌。菌丝是霉菌营养体的基本单位。根据霉菌菌丝中是否存在隔膜，分成无隔膜菌丝和有隔膜菌丝两种类型（图3-8）。无隔膜菌丝含有多个细胞核，为低等真菌菌丝类型，如毛霉属（Mucor）和根霉属（Rhizopus）；有隔膜菌丝中有隔膜，被隔膜隔开的一段菌丝就是一个细胞，每个细胞内有一个或多个细胞核，在隔膜上有一个至多个小孔，使细胞之间的细胞质和营养物质可以相互沟通，为高等真菌菌丝类型，如曲霉属（Aspergillus）和青霉属（Penicillium）。菌丝可伸长并产生分枝，许多分枝的菌丝相互交织在一起，构成菌丝体。菌丝体分为深入固体营养基质内部吸收营养物质的营养菌丝体和由营养菌丝向空气中生长延伸形成的气生菌丝体。两类菌丝体在长期进化中发展出各种特化的结构，如营养菌丝体的假根、匍匐菌丝等，气生菌丝的分生孢子头、孢子囊等。

图3-8 霉菌的无隔膜菌丝（1）和有隔膜菌丝（2）

一、霉菌的经济价值

霉菌在自然界中分布非常广泛，与人们的日常生活极为密切。早在古代，人们就用其酿酒、制醋。当前，霉菌广泛应用于食品发酵、天然色素提取、抗生素生产、生物防治和酶制剂制备等方面。另外，霉菌对人类也有其有害的一面，如可使食品、纺织品霉变，农作物患病，感染人、畜，产生霉菌毒素等。

霉菌在食品加工工业中用途十分广泛。许多酿造发酵食品，如豆腐乳、豆豉、酱油、酱、食醋、柠檬酸和苹果酸等都是在霉菌的参与下生产加工出来的。多数霉菌能把加工所用原料中的淀粉、糖类等碳水化合物和蛋白质等含氮化合物及其他种类的化合物进行转化，制造出多种多样的食品、调味品及食品添加剂。霉菌是天然色素的重要来源之一，如红曲霉（Monascus purpureus）生产的红曲色素具有极好的稳定性，已广泛应用于食品工业中；三孢布拉霉菌（Blakeslea trispora）和布拉克须霉（Phycomyces blakesleeanus）已用于β-胡萝卜素的工业化生产中。青霉素是人类发现的第一种抗生素，在革兰阳性细菌所致的感染性疾病的治疗中发挥了巨大作用。除了青霉素以外，灰黄霉素、头孢霉素等也来源于霉菌。某些根霉能产生一种对芽孢菌属细菌有独特抑制作用的碱性多肽物质，可抑制食品、发酵工业中常见的枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌等细菌污染。研究应用较多的生防真菌是木霉属（Trichoderma）种类。拮抗性木霉至少对18个属中的29种植物病原真菌具有拮抗作用。绿色木霉（Trichoderma viride）的分生孢子和厚垣孢子对由黄瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum）引起的枯萎病有很好的防治效果；木霉TR-5菌株对立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、禾谷丝核菌（Rhizoctonia cerealis）、西瓜枯萎病菌、油菜菌核病菌（Scterotinia sclerotiorum）、昆明腐霉（Pythium kunmingens）和寄生疫霉（Phytophthoraparasitica）等6种病原真菌都具有极强的拮抗作用，其分生孢子制剂在室温条件下对黄瓜猝倒病（Pythium aphanidermatum）和黄瓜疫病（Phytophthora drechsleri）具有较好的防治效果，防治效果分别达到88.21%和94.45%。木霉菌的拮抗作用机制主要有竞争作用、重寄生作用、抗生作用和诱导抗性作用等，在对病原真菌发生作用时往往是多种生防机制共同作用。例如，在木霉菌发生重寄生作用时往往伴随着胞外水解酶的分泌，当木霉菌菌丝对病原菌的菌丝进行吸附、缠绕和寄生时，这些胞外的水解酶也可以对病原菌的细胞壁进行水解。目前，国内外已经开发出50多种木霉菌商品化制剂，年销售额达2.5亿美元。这些制剂在植物病害防治中都取得了很好的效果。这些木霉菌不仅能防病，还具有促进植物生长、提高营养利用效率、增强植物抗逆性和修复农化污染环境等功能。

米曲霉（Aspergillus oryzae）和黑曲霉（Aspergillus niger）常用于生产淀粉酶，其中黑曲霉产生的淀粉酶耐酸性较强，黑曲霉NRRL330淀粉酶的最适pH为4.0，在pH 2.5常温下处理30min尚不失活。在工业中应用的糖化酶主要是从黑曲霉、米曲霉、根霉和红曲霉等霉菌中获得的。市售的食品级果胶酶主要来源于黑曲霉。一般用于生产的纤维素酶主要来自于木霉属、曲霉属和青霉属。

二、霉菌的准性生殖与准性杂交

准性生殖是指同种生物两个不同菌株的体细胞（即带有不同遗传性状的两个单倍体细胞或菌丝）经融合后，不经减数分裂而导致低频率基因重组并产生重组子的生殖方式。20世纪50年代，科学家在对构巢曲霉（Aspergillus nidulans）的研究中，首先发现了准性生殖。准性生殖是霉菌，尤其是不产生有性孢子霉菌特有的遗传现象。工业上用于生产抗生素和酶制剂的黑曲霉、米曲霉、扩展青霉（Pencillium expansum）和产黄青霉（Penicilliumchrysogenum）等均可通过准性杂交进行菌种选育。

1.准性生殖过程

准性生殖可以分为四个过程：菌丝联结、异核体的形成、杂合二倍体的形成、体细胞交换和单元化（图3-9）。

（1）菌丝联结 发生在形状相同，但在遗传性上有差别的同一菌种的两个不同菌株体细胞（单倍体）间。发生频率极低。

（2）异核体的形成 当菌丝联结时，联结处的细胞壁溶解、细胞膜融合、细胞质交流，在融合的细胞中两个细胞核共存，这种细胞称为异核体。由异核体细胞发育成的菌株称为异核体菌株。异核体细胞质中的两个细胞核处于游离状态，是独立的，相互间没有融合与交换，而细胞质却完全融合。

以构巢曲霉为例。当把构巢曲霉A接合型的亮氨酸缺陷突变菌株（leu ^-met⁺）与A接合型的蛋氨酸缺陷突变菌株（leu⁺met^-）混合接种在基本培养基上培养时，常可以产生少量原养型菌落，这些菌落是异核体。这是因为两个亲本的菌丝间发生相互联结，形成了细胞质和细胞核相互混杂的异核体。在异核体中两种细胞核能彼此提供所缺少的酶，因此在不添加亮氨酸和蛋氨酸的情况下即可在基本培养基上生长。

图3-9 霉菌准性生殖过程示意

将两个营养缺陷型菌株混合培养时，出现原养型菌落的原因可能是由于互养、异核体、二倍体或单倍重组体的存在。还需要进一步证明原养型菌落的出现是否由于异核体所致。

①互养的排除：互养作用也能使两个具有不同营养缺陷型标记的菌株在基本培养基上生长。从原养型菌落上取下少量菌丝，接种于养料贫乏的培养基上；切取一段从接种处向外长出的菌丝的尖端，放在基本培养基上培养。如果原养型菌落的出现是由于互养所致，那么菌丝尖端就不会生长；而如果是异核体所致，那么菌丝尖端就能在基本培养基上继续生长。

②二倍体或单倍重组体的排除：为了排除二倍体或单倍重组体的存在，将leu ^-met⁺菌株和leu⁺met^-菌株的分生孢子混合接种在基本培养基上，取出其上长出的原养型菌落的单个菌丝尖端，接种于基本培养基上，得到由单个菌丝尖端所长成的培养物。收集该培养物上的孢子，分别接种于基本培养基和含有亮氨酸、蛋氨酸的培养基上。经培养发现，在基本培养基上没有长出菌落，而在含有亮氨酸、蛋氨酸的培养基上长出了菌落。由于构巢曲霉的分生孢子是单核的，因此由异核体产生的分生孢子，其核型为leu ^-met⁺或leu⁺met^-，所以它们只能在含有亮氨酸、蛋氨酸的培养基上生长，而不能在基本培养基上生长。而二倍体和重组单倍体的核型分别为leu ^-met⁺/leu⁺met^-、leu⁺met⁺，故其能在基本培养基上生长。根据实验结果可知，上述原养型菌落的出现并非由二倍体或单倍重组体所致，而是由异核体所致。

异核现象在自然界普遍存在。异核体包含着不同基因型的细胞核，具有生长优势，且具有更好的环境适应能力；在异核体中隐性的突变基因可以得到有效的保护和储存；在异核体内，2个不同营养缺陷型的细胞核具有互补作用，因此在霉菌中可用异核体来测定等位基因；此外，在异核体中，由于两种遗传型不同的核并未融合，因此能分离出2个亲本型菌株，但2个亲本的细胞质在异核体中是融合的，故由细胞质所控制的特性在杂交子代中就不会出现分离现象，因此，异核体可以用来研究霉菌的细胞质遗传。

异核体在接合型相同的菌株间较容易形成，在接合型不同的菌株间较难形成，其难易程度与一些基因有关。就构巢曲霉而言，Garnjobst认为有2个基因与异核体的形成有关，Holloway认为至少有4个基因。在粗糙链孢霉（Neurospora crassa）中，则发现至少有10个基因与异核体的形成相关。还有些霉菌则很难形成异核体，有些类似于高等生物中的“不亲和”现象。

（3）杂合二倍体的形成 核融合是指两个单倍体核融合形成一个二倍体核的现象。基因型相同的核融合形成纯合二倍体，基因型不同的核融合形成杂合二倍体。异核体中两个基因型不同的细胞核可以以极低的频率融合成杂合二倍体。研究表明，异核体发生核融合而产生二倍体的概率为10 ^-7～10 ^-5。用樟脑蒸气、紫外线或高温等理化因素处理，可提高杂合二倍体产生的频率，其原因可能是在处理的过程中使某些抑制核融合的基因发生了突变。

如果把大量的异核体所产生的分生孢子接种在基本培养基上，可以长出少数菌落，这些菌落不同于混合接种leu ^-met⁺株和leu⁺met^-株的孢子，在基本培养基上所出现的原养型菌落。因为原养型菌落的分生孢子不能在基本培养基上形成菌落，而从这些少数菌落上取得的分生孢子都能在基本培养基上形成菌落，可见这些菌株是二倍体菌株而不是异核体。

野生型构巢曲霉产生绿色分生孢子（W⁺Y ⁺），它的2个营养缺陷突变型分别产生黄色分生孢子（W⁺Y ^-）和白色分生孢子（W^-Y ⁺）。这2个突变型可以形成基因型为W⁺Y ^-//W^-Y ⁺的异核体，按常规推断，这样的异核体产生的分生孢子应该是黄色或白色的。但Pontecorvo等人在1956年对W⁺Y ^-//W^-Y ⁺异核体进行研究时发现，在培养基中可产生形成绿色孢子的菌株。能形成绿色分生孢子菌株的细胞内只有一个核，且其DNA的含量为亲本DNA含量的2倍。后来研究表明绿色分生孢子的形成是由于异核体中2个不同基因型的单倍体细胞核在繁殖过程中融合成一个杂合二倍体细胞核（W⁺Y ^-/W^-Y ⁺）的缘故。由于白色突变型和黄色突变型对于绿色野生型来讲都是隐性的，所以杂合二倍体的分生孢子呈绿色。

（4）体细胞交换和单元化 准性生殖过程中产生的二倍体并不像有性生殖过程中的二倍体那样进行减数分裂，它们仍以有丝分裂的形式进行增殖。然而杂合二倍体（W⁺Y ^-/W^-Y ⁺）所产生的分生孢子并不都是绿色的，有时会产生出少量黄色或白色的分生孢子。这是因为杂合二倍体虽然比异核体稳定，其所产生的分生孢子通常也都是二倍体的。但稳定性是相对的，杂合二倍体也会发生基因分离和重组，其基因分离重组后所形成的重组体、非整倍体或单倍体统称为分离子。因为它们都是体细胞，所以又称体细胞分离子。产生非整倍体或单倍体的过程称为单元化，产生重组体的过程称为体细胞交换。分离重组的结果是，若杂合二倍体W⁺Y ^-/W^-Y ⁺变成了重组二倍体W⁺Y ^-/W^-Y ^-，则分生孢子由绿色变成黄色；若变成W^-Y ^-/W^-Y ⁺，则分生孢子由绿色变为白色。

那么，体细胞内的基因是如何进行重组的呢？原来二倍的体细胞在进行有丝分裂时，同源的2条染色体虽不像减数分裂那样有明显而严整的联会并形成四分体的过程，但其2条染色体各自复制后也形成4条染色单体。在这样的“四线期”，同源染色体的2条非姊妹染色单体间偶尔也可以进行等价交换。2个进行了等价交换的染色单体在分裂后期可以同时趋向细胞的同一极，也可以各趋向一极。

体细胞在有丝分裂过程中，如果没有交换，同源染色体的非姊妹染色单体间随机组合在一起进入一个子细胞，那么这对染色体上的杂合基因对就一直保持杂合状态。而如果在2条非姊妹染色单体间发生了交换，则在交换区段内姊妹染色单体间的基因组成就可能是不同的，而在非姊妹染色单体间就可能是相同的。当带有相同染色单体片段的非姊妹染色单体共同进入一个细胞时，就会使原来呈杂合状态的基因型变成纯合状态，导致部分基因纯合化。这就是体细胞重组（somatic recombination）或称有丝分裂重组。重组的结果是出现不同于2亲本的重组体（图3-10）。图3-10中AbCd/aBcD是一个杂合二倍体，在有丝分裂过程中同源染色体间发生交换，结果出现了AbCd/aBCd、AbcD/aBcD、AbCd/aBcD和AbcD/aBCd四种重组体。在AbCd/aBCd重组体中，C、d基因呈纯合状态；在AbcD/aBcD重组体中，c、D基因呈纯合状态；而 AbCd/aBcD和AbcD/aBCd重组体仍为杂合二倍体。

图3-10 同源染色体交换形成重组体

Kafer在研究杂合二倍体细胞有丝分裂时发现，其通过产生非整倍体或单倍体的单元化过程也可以形成重组体。在正常的有丝分裂过程中，染色体一分为二，各自在纺锤体的作用下趋向细胞的一极，使子细胞各含有一条染色体。当纺锤体断裂或其他原因造成染色体不分离时，分裂后的两条染色体会趋向同一极，进入同一个细胞，那么这个细胞就多了一条染色体（2n+1），而对应的另一个细胞就缺少了一条染色体（2n-1），它们都是非整倍体。2n+1非整倍体亦称为三体，其在有丝分裂过程中常会失去一条染色体而恢复成二倍体。在这一过程中就有可能导致部分基因的纯合，形成新的重组体（图3-11）。2n-1非整倍体亦称为单体，在有丝分裂过程中常会陆续失去其他一些染色体而最终成为单倍体。由于失去的染色体不同，所得到的单倍体重组体也是各种各样的。

在准性生殖过程中，体细胞交换和单元化是两个独立发生的过程，体细胞交换产生部分基因纯合的二倍体重组体，而单元化过程则产生各种类型的非整倍体和单倍体重组体。它们发生的概率都很小，而在同一个细胞内或同一条染色体上同时发生的概率更小。根据对大量分离子的分析，发现在准性生殖过程中二倍体核中发生体细胞交换的概率为10 ^-2，二倍体产生单倍体的概率为10 ^-3。

图3-11 通过单元化产生重组体

2.霉菌准性杂交育种

霉菌准性杂交育种是利用准性生殖过程中的基因重组和分离现象，将不同菌株的优良特性集合到一个新菌株中，然后通过筛选获得具有新遗传结构和优良遗传特性的新菌种。霉菌准性杂交育种过程主要有以下几个重要环节。

（1）亲本菌株的选择 亲本菌株的选择又分为原始亲本的选择和直接亲本的选择。用来进行杂交的两个野生型菌株称为原始亲本。原始亲本经过诱变以后得到各种突变型菌株；假设这种菌株是用来作为形成异核体的亲本，就称为直接亲本。与常规杂交育种一样，应选择那些亲和力强又携带明显营养标记和辅助标记的菌株作为准性杂交育种的直接亲本。

霉菌直接亲本的亲和力试验可采用衔接法或混合法：将两个配对菌株共同接种于基本斜面或基本液体培养基中，若能形成异核体菌丝丛或呈絮状生长，则表明此两菌株具有亲和力，该组合可用于杂交试验。例如，用青霉素产生菌产黄青霉和灰黄霉素产生菌荨麻青霉（Penicillium urticae）的营养缺陷型作为杂交直接亲本进行亲和力试验，以100对杂交组合进行测定，其中只有14对组合具有亲和能力，占测定总数的14%。带有遗传标记的直接亲株的筛选是杂交育种的重要环节之一。作为直接亲本的遗传标记有多种，如营养缺陷型、抗药性突变型和形态突变型等，目前应用较普遍的是营养缺陷型菌株。

（2）异核体合成方法 合成异核体首先要将两个直接亲本菌株的分生孢子或菌丝体进行混合接种、培养，使两个配对菌株的细胞彼此接触，进而促进细胞壁融合和细胞质交流。异核体的合成方法主要有以下几种。

①完全培养基混合培养法：将配对菌株新鲜孢子混合接种于液体完全培养基中，适温培养1～2d，待长出年轻的菌丝后，用生理盐水洗涤，离心数次，除去黏附的培养基，用无菌镊子把菌丝撕碎，并摊布于基本培养基平板上，培养7～8d后，长出异核体的菌丝丛，挑取其上孢子置于基本培养基斜面保存。当两个直接亲本的分生孢子不易融合时，采用该方法较易获得异核体。

②基本培养基衔接法：从新鲜斜面取两个配对菌株的分生孢子，用生理盐水洗涤数次，制成高浓度的孢子悬液。用无菌的少量脱脂棉裹在接种针的前端，蘸取适量两亲本的孢子悬液，将其接种到基本培养基斜面的两端。接种长度约为斜面的2/3，而两菌株接种的衔接部分约为1/3。适温培养后，衔接部分长出异核体菌丝丛。进一步考证、纯化之后，移入基本培养基斜面保存。据报道，该方法获得异核体的频率最高。

③有限培养基培养法：有限培养基一般是在基本培养基中加入10%的完全培养基。该方法可分为液体静止培养法和固体平板培养法两种。液体静止培养法是在盛有液体有限培养基的三角瓶中接入两个配对菌株的分生孢子，培养1～2d。待长出年轻的菌丝后，将其撕碎并摊布于基本培养基平板上，培养6～8d，将长出的异核体菌丝丛移入斜面保存。固体平板培养法是将两个配对菌株的等量孢子制成混合孢子悬液，涂布于有限培养基固体平板上，每个平皿的孢子密度控制在60～80个，培养6～8d，在两个亲本菌落间形成异核体菌丝丛。

（3）异核体的检出 采用以上几种培养方法所获得的菌丝丛不一定都是异核体，还需要进一步验证。根据异核体的特点可采用以下两种方法：①把以上异核体的菌丝，单独一条一条地挑取，置于基本培养基上培养，凡是能重新形成菌落的，即为异核体菌株，这种方法可以排除互养菌株；②把异核体菌落上的大量分生孢子涂布在基本培养基上，观察是否出现杂合二倍体的特征，若有，则说明菌落确实是由异核体形成的。

（4）杂合二倍体的形成和检出 杂合二倍体由异核体中两个基因型不同的单倍体细胞核融合而成，其在异核体的菌丝内和其他单倍体细胞核一起繁殖，直到异核体形成菌落并产生分生孢子。杂合二倍体就在异核体菌落表面上形成与异核体颜色不同的（一般类似野生型）角变（扇形）或斑变（斑点）分生孢子。杂合二倍体并不是两个单倍体细胞核简单的加倍，而是已具有杂种的特性。它包含着两个直接亲株的全部隐性基因，在繁殖过程中，随着基因的重组和分离，产生少量的各种不同类型的重组分离子。

杂合二倍体的营养要求、生长习性、孢子颜色或菌落形态结构通常与野生型相似。用以下方法可以检出杂合二倍体：①用接种针挑取角变或斑点上的分生孢子，进行分离、纯化，即可获得纯杂合二倍体；②把异核体菌丝撕碎，摊布于基本培养基平板上，经培养后，在长出的异核体菌落上寻找原养型的角变或斑点，挑取其分生孢子，进一步分离、纯化，获得纯杂合二倍体；③把异核体上的分生孢子涂布于基本培养基平板上，每个平皿的孢子数约为1×10⁶个，经培养后，在形成的菌落中挑出与野生型相似的角变或斑点，挑取其分生孢子，进行分离、纯化后得到纯杂合二倍体。

杂合二倍体是霉菌准性生殖过程中的重要组成部分，也是准性杂交育种中的关键一步。由于杂合二倍体都是从异核体菌落或异核体菌丝上挑出来的，通常会带有两直接亲株的分生孢子，为获得纯杂合二倍体菌株，需要进行多次的分离、纯化。在获得纯杂合二倍体菌株后，还要对它的形态、生理和遗传等特性进行研究。

（5）分离子的检出和测定方法 杂合二倍体经过体细胞交换和单元化后产生的子细胞称为分离子。分离子种类很多。根据分离子的营养要求、菌落形态或孢子颜色等表型，可将其分为亲本分离子、原养型分离子和异养型分离子三类。亲本分离子的营养要求、孢子颜色都和直接亲本相同，基因型和亲本也一样。原养型分离子在培养过程中表现出不缺少两直接亲本所缺陷的营养，能在基本培养基上正常生长，菌落孢子颜色通常与野生型相同。从基因型分析，这种分离子由于重新组合，或许其已不带营养缺陷标记，或者营养缺陷标记仍在，但处于隐性状态并未表现出来。异养型分离子在培养过程中表现出与两直接亲本部分相同的营养缺陷，说明其基因型虽然是重建了，但还是带有部分原有营养缺陷标记。原养型分离子和异养型分离子由于基因型发生了重建，故又称为重组型分离子。

虽然杂合二倍体用诱变剂或重组剂诱发，可以提高分离子产生的频率，但总的来说，分离子产生的数量仍然很少（图3-12）。目前，主要依据分离子所携带的隐性标记来从大量菌落中识别和检出各种分离子，主要方法有以下两种：①用选择性培养基筛选分离子，如筛选抗对氟苯丙氨酸的分离子，可以把大量杂合二倍体孢子分离在含有0.01mol/L对氟苯丙氨酸的培养基平板上，经过培养，凡带有抗药性隐性突变基因的分离子（纯合二倍体fpa/fpa和单倍体fpa）能形成菌落，而对药物敏感的孢子则不能在其上生长；②用完全培养基筛选分离子，将杂合二倍体菌落产生的分生孢子分离在完全培养基平板上，培养至菌落成熟，在大量菌落中找到个别菌落上出现带有颜色隐性标记突变的角变或斑变，挑取其上的分生孢子移接于完全培养基斜面上，培养后经过纯化和鉴别即得分离子。(www.daowen.com)

图3-12 分离子产生的频率

从杂合二倍体中检出的分离子，须先进行分离纯化，然后对它们的特性进行全面测定分析，包括菌落形态、营养要求、孢子颜色、孢子大小、孢子DNA的含量和代谢产物的产生水平等。

（6）高产重组体的筛选 杂交育种的目的是要获得具有高产性能的稳定新型重组体菌株。通过准性杂交技术得到的异核体和杂合二倍体在遗传上是不稳定的，在繁殖过程中会发生染色体交换、基因重组和分离，只有单倍重组体才是稳定的。在进行霉菌准性杂交育种时需要注意以下几点：①选择的两个亲本菌株，不仅要具有不同的优良性状，而且最好是近亲配对组合，这样易获得产量高的重组体，远亲杂交虽然也能得到杂合二倍体，但经诱变处理后，会发生严重的遗传分离现象，产量将大幅度下降，难以达到育种目的；②用合适的诱变剂处理杂合二倍体，促进其体细胞交换和单元化过程，进而选出具有高产和其他优良性状的单倍重组体；③对获得的单倍重组体进行代谢调节，即筛选适应酶系统代谢调控的突变株，使高产单倍重组体能够充分发挥其高产潜力；④单倍重组体在摇瓶筛选阶段，应做到摇瓶培养条件和大生产条件尽量接近，以便新菌种能应用到大生产中去。

在霉菌准性杂交育种中有不少成功的实例，如产黄青霉通过准性杂交育种，获得了高产新型重组体菌株，其产量比亲本菌株提高了约8倍；酱油曲霉（Aspergillus sojae）通过准性杂交育种，获得了蛋白酶活力及曲酸产量提高的重组体菌株，其蛋白酶活力与亲株相比提高了1倍。

三、青霉属

青霉（Penicillium）属于真菌界（Eumycophyta），子囊菌门（Ascomycota），盘菌亚门（Pezizamycotina），散囊菌纲（Eurotiomycetes），散囊菌目（Eurotiales），发菌科（Trichocomaceae），发菌亚科（Thichocomoideae）；以前曾被归类到半知菌门（Deuteromycota）、丝孢纲（Hyphomycetes）、丝孢目（Hyphomycetales）、丛梗孢科（Moniliaceae）。青霉菌丝细胞之间有隔膜，细胞内通常为多核。整个菌丝体分为营养菌丝体和气生菌丝体，其中营养菌丝体无色、淡色或具鲜明颜色，气生菌丝密毡状、松絮状或部分集结成菌丝索。气生菌丝上产生分生孢子梗，其顶端生有扫帚状的结构称为帚状枝。帚状枝由单轮生或2次到多次分枝系统构成，最后一级分枝即产孢细胞称为瓶梗，着生瓶梗的细胞是梗基，支持梗基的细胞是副枝，分生孢子自瓶梗上用断裂法生出并成链状排列（图3-13）。分生孢子为球形至卵形，呈绿色、蓝色或黄色，即通常看到的各种青霉菌落特有的颜色。

图3-13 青霉分生孢子器

青霉在自然界中分布广泛，其分生孢子在土壤中、空气中及腐烂的物质上到处存在。青霉营腐生生活，其营养来源极为广泛，是一类杂食性真菌，可生长在任何含有有机质的基质上。在25～28℃、偏酸性、潮湿、通风性不好的环境中最易滋长青霉，它的孢子对热、冷、干燥和紫外线等不良环境均有较强的抗性。青霉与人类生活息息相关，如许多种青霉能造成柑橘、苹果、梨等水果的腐烂；能在工业产品、食品和衣物上生长，从而使其霉变；少数种类是人和动物的致病菌；同时也是一种常见的实验室污染菌。另一方面，青霉对人类的生产生活又至关重要，它可用于生产柠檬酸、延胡索酸、葡萄糖酸、漆酶、纤维素酶和木聚糖酶等有机酸和酶制剂；用于酿制丹麦青干酪、娄克馥干酪等；青霉产生的青霉素是人类最早发现、最先提纯和最早临床应用的抗生素。

1949年，Raper和Thom第一次提出青霉的分类系统。根据青霉特有的帚状枝结构把青霉分成4个组：①单轮青霉组，其帚状枝全由单轮生瓶梗构成；②对称二轮青霉组，有紧密轮生的梗基，梗基上着生细长渐尖的瓶梗，全部帚状枝对主梗而言，大体对称像漏斗，分生孢子大多为椭圆形；③不对称青霉组，是青霉中最大的一组，主要包括帚状枝做2次或多次分枝、对主梗而言不对称的种（图3-13）；④多轮青霉组，帚状枝极为复杂，常做多次分枝而且常是对称的。

传统的青霉分类依赖于纯培养物分离方法，通过细胞形态学特征，结合生理生化反应和细胞组成成分及结构进行分类鉴定。近年来，许多分子标记技术被用来进行青霉菌的分类和鉴定，如限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性（RAPD）、扩增片段长度多态性（AFLP）、rDNA/rRNA序列分析、β-微管蛋白基因序列分析和钙调蛋白基因序列分析等。随着分子生物学和相关技术的迅速发展，分子标记技术以其快速、准确、灵敏的优点逐渐成为青霉分类鉴定的主要手段。但是目前还没有一种分子标记技术能单独胜任对青霉的鉴定，将传统方法和分子生物学方法结合起来对青霉进行分类鉴定才能获得较满意的结果。

青霉能在许多不同的环境下生长，具有去除重金属、降解酚类、卤素酚类和多环芳香烃类等化合物的能力。重金属铅、锌、铜、镉等离子均能对环境、人体造成较大的危害，因此从环境中去除这些有害重金属具有重要的意义。简青霉（Penicillium simplicissimum）对Pb²⁺和Cd²⁺具有较强的吸附能力，在最佳吸附条件下，吸附量可分别达到36.65mg/g和26.5mg/g。简青霉的吸附作用机理主要有表面络合作用和离子交换作用。表面络合作用是指当简青霉暴露于金属溶液中时，金属离子首先与它的细胞壁相接触。简青霉细胞壁主要由各种多糖构成（高达90%），这些多糖常与蛋白质、脂肪和色素等物质键合在一起，形成复合物。细胞壁上官能团（如羧基、磷酰基、羟基和酰胺基等）内含有的N、O、P等电负性较大的原子均可以提供孤对电子，与重金属离子在细胞表面形成络合物或螯合物，而使溶液中的重金属离子被吸附。离子交换是细胞结合的金属离子被另一些结合能力更强的金属离子代替的过程。研究发现，简青霉吸附前的铅溶液中测不出Ca²⁺、Mg²⁺的浓度，但吸附后溶液中这两种离子的浓度分别达到0.71mg/L和0.36mg/L，表明在简青霉吸附重金属离子的过程中存在着离子交换。氧化还原反应、微沉淀以及主动运输也对微生物吸附重金属离子有一定的作用，但这些作用由于吸附量少而不易被检测出来。

苯及其衍生物、酚类化合物、卤素化合物和氟素化合物等污染物广泛存在于土壤、水和空气中，对生物体具有较强的毒害作用。目前这些污染物多用化学和物理方法来去除，如萃取、膜分离、活性炭吸附和电化学氧化等。虽然这些方法具有一定的效果，但其成本较高，对操作条件有较高要求，并易形成二次污染物。生物降解因其成本低，并能将这些污染物完全矿化而成为一种很有潜能的降解方式。一些青霉已经被用来降解酚类化合物，以降低其致突变、致畸和致癌等毒性。如简青霉SK9119菌株能以苯酚和单氟酚为唯一碳源生长并对其进行有效的降解；产黄青霉CLONA2菌株能有效地降解邻苯二酚和对苯二酚。

四、曲霉属

曲霉属在生物分类系统中为发菌科的一个成员，是发酵工业及食品加工业的重要真菌，广泛分布于谷物、空气、土壤和各种有机物品上。两千多年前，我国就已利用各种曲霉菌来制酱，其也是酿酒、制醋曲的主要菌种。现代工业可利用曲霉生产各种酶制剂（如淀粉酶、磷酸二酯酶、果胶酶和蛋白酶等）、有机酸（如柠檬酸、五倍子酸和葡萄糖酸等）。然而，曲霉家族中也有一些对人类有害的种类，如黄曲霉的有些菌系能产生黄曲霉毒素，不仅能造成家禽和家畜中毒甚至死亡，而且还是一种强致癌物质。常见的曲霉有黄曲霉（Aspergillus flavus）、黑曲霉、米曲霉（Aspergillus oryzae）和烟曲霉（Aspergillus fumigatus）等（图3-14）。

图3-14 几种常见曲霉形态结构示意

曲霉菌丝有隔膜，部分气生菌丝可以分化成分生孢子梗，分生孢子梗顶端膨大成为顶囊，顶囊一般呈球形。在顶囊表面以辐射状生出一层或二层小梗（初生小梗与次生小梗）。最上层小梗呈瓶状，顶端着生成串的球形分生孢子，孢子一般呈黄、绿、黑、褐、橙等颜色。分生孢子梗生于足细胞上，并通过足细胞与营养菌丝相连。曲霉中分生孢子梗的长度、顶囊的形状、小梗着生是单轮还是双轮，以及分生孢子的形状、大小、表面结构及颜色等，都是菌种鉴定的依据（图3-14）。曲霉属中的大多数仅发现了无性阶段，只有少数种能进行有性繁殖，产生子囊孢子。

1.黄曲霉

黄曲霉是一种常见的腐生真菌，常生长于透气的食物表面。菌落生长较快，结构疏松，表面黄绿色，背面无色或略呈褐色。黄曲霉菌主要感染花生、玉米等含油量高的农作物和粮食制品。黄曲霉一般只产生无性孢子，有性的子囊孢子少见。黄曲霉是仅次于烟曲霉的第二大可以感染人的曲霉菌，感染人的肺和大脑后可导致梗死，也能使角膜、耳朵和鼻眶感染疾病。黄曲霉的大部分菌株可以产生黄曲霉毒素。该化合物具有强毒性和致癌性，对人畜健康产生极大的威胁。

（1）黄曲霉毒素的种类及化学结构 最早发现的黄曲霉毒素为AFB1、AFB2、AFG1和A F G2四种，均含有一个双呋喃环和香豆素结构（氧杂萘邻酮），前者是其基本毒性结构，后者与致癌相关。在紫外光下AFB1和AFB2发蓝色荧光，AFG1和AFG2发绿色荧光。四种毒素可以通过薄板层析法区分开。随后在牛乳中又发现了AFM1和AFM2两种毒素，是由AFB1和AFB2在体内经羟化衍生得到的。目前已发现黄曲霉毒素及其衍生物有20余种，其中18种已初步鉴定结构。AFB1的毒性及致癌性最强，其次依次为AFG1、AFM1、AFB2、AFG2和AFM2（图3-15）。黄曲霉毒素在水中的溶解度范围为10～20mg/L，可大量溶解于氯仿、甲醇、乙腈和二甲基亚砜等中等极性的有机溶剂中，但不溶于石油醚、己烷和乙醚。一般在中性溶液中较稳定，在强酸性溶液中稍有分解，在pH 9～10的碱性溶液中迅速分解，也易被强氧化剂分解。黄曲霉毒素纯品为无色结晶，耐高温，AFB1的分解温度为268℃，紫外线对低浓度的黄曲霉毒素也有一定的破坏性。

图3-15 六种常见黄曲霉毒素的分子结构

（2）黄曲霉毒素的生物合成及其危害 黄曲霉毒素的主要结构为双呋喃环和香豆素结构，其合成过程与脂肪酸的生物合成过程相似。由乙酰辅酶A作为起始单元，丙二酸单酰辅酶与之反应，在聚酮化合物合酶的作用下生成黄曲霉毒素的聚酮骨架，再经过氧化、环化、甲基化等系列反应后生成黄曲霉毒素。2004年研究人员报道了完整的黄曲霉毒素合成相关基因，其合成基因簇长约70kb，共有25个基因。黄曲霉毒素毒性比KCN大10倍，比砒霜大68倍，仅次于肉毒菌素，是目前已知霉菌毒素中毒性最强的毒素，会引起急性或慢性肝脏损害。黄曲霉毒素也是已知的自然存在的最强致癌物之一，能致使p53肿瘤抑制因子中第249个密码子的G转换成T（位于内含子区域），从而导致肝癌的发生。黄曲霉毒素也可以通过被污染的动物饲料，通过食物链进入动物体内，从而污染牛乳及乳制品，AFB1可经过代谢转变为AFM1。对此，美国食品和药品管理委员会设立的黄曲霉毒素允许检测含量标准为：食品中黄曲霉毒素含量不能超过15μg/kg，牛乳中含量不能超过0.5μg/kg，饲料中黄曲霉毒素含量则不能超过300μg/kg。目前，中国花生、玉米等粮食作物中的黄曲霉毒素的允许含量为20μg/kg，大米、其他食用油中不得超过10μg/kg，其他粮食、豆类和发酵食品中不得超过10μg/kg。

（3）黄曲霉毒素的检测分析黄曲霉毒素能导致严重的食品安全问题，因此需要对黄曲霉毒素进行高效的定性定量分析检测。目前，黄曲霉毒素的检测分析方法主要有色谱法和免疫化学法。色谱法有薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）和液相色谱质谱联用法（liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS）。薄层色谱法适用于定性分析少量样品（最少可至0.01μg），可以快速分离黄曲霉毒素，是国内外测定食品或饲料中AFB1含量的主要方法。该方法的缺点是精确度和灵敏度较低，不适合复杂样品中的黄曲霉毒素测定。HPLC法是目前较为常用的黄曲霉毒素检测方法，已广泛应用于玉米、花生、牛乳及乳制品等农作物及食品的黄曲霉毒素检测。LC-MS法是目前最先进的检测方法，液相色谱能有效地将待测样品中的有机物成分分离开，质谱则对分开的有机物进行分析，得到有机物分子质量、浓度甚至化学结构等信息。由于检测的高准确度和高灵敏度，该方法已成为药品及食品检验检疫、生产过程控制、质检等部门不可缺少的分析工具。但该方法对仪器设备、环境条件和操作人员素质等要求较高，目前在黄曲霉毒素检测中的应用还不够广泛。

免疫化学法（immuno chemical methods，ICM）是以抗原抗体间的竞争反应进行抗原抗体含量测定的方法，具有灵敏性高、特异性高、样品处理简单等优点。免疫化学法主要有酶联免疫分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、放射免疫分析（radio immunoassay，RIA）和荧光免疫分析（fluorescence immunoassay，FIA）等方法。近年来，免疫化学法发展较快，在黄曲霉毒素的检测分析中得到了广泛的应用，尤其是特异性黄曲霉毒素抗体的获得使ELISA成为食品黄曲霉毒素初筛的主要技术手段。

2.黑曲霉

黑曲霉是常见的曲霉属，广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。黑曲霉菌落初期呈白色，成熟之后逐渐变成棕色，孢子区域呈黑色，菌落绒毛状，边缘不规则。菌丝有隔膜和分枝，为多细胞菌丝体，有足细胞，顶囊生成一层或两层小梗，小梗的顶端生有一串串的分生孢子（图3-14）。黑曲霉一般进行无性繁殖，最适生长温度为33～37℃，最适生长pH为3～7。

2007年，荷兰工业化学公司（DSM）首次完成了对黑曲霉CBS513.88菌株的全基因组测序。其基因组全长约为33.9Mb，具有1400多个开放阅读框（ORF）。目前共有三株黑曲霉完成了全基因组测序。随着黑曲霉基因组数据的公布，对于黑曲霉的研究也进入了后基因组时代，基因组数据为比较基因组学和功能基因组学研究的深入开展奠定了基础，一系列组学研究被广泛应用于黑曲霉研究中，如转录组学、蛋白质组学以及代谢组学等。Meyer等通过Microarray技术分析了黑曲霉在抗真菌药物胁迫环境下的基因表达数据；Lu等通过二维电泳技术完成了黑曲霉淀粉酶产生菌在分别以麦芽糖和木糖为碳源条件下的比较蛋白质组研究，发现在诱导和非诱导条件下黑曲霉的分泌蛋白质组并没有明显差异；DSM公司从转录和翻译两方面比较了三株酶生产菌与野生型的差别，发现其细胞应答会随着产物性质和数量的不同而有所差异。

转录组、蛋白质组和代谢组学数据的发表推动了代谢工程研究的不断深入，为细胞工厂的设计奠定了基础。Pel等第一次鉴定了黑曲霉CBS513.88基因组的14165个ORF，通过同源性比对和已有实验数据注释了其中6506个ORF的功能，建立了含有1069个独特反应的代谢网络；天津工业生物技术研究所的孙际宾等重建了黑曲霉基因组规模的代谢网络模型，涉及4000多个基因，999个不同的酶序列号，2443个代谢反应和2349个代谢产物，并应用此网络模型率先分析了黑曲霉高产柠檬酸的机理；Nielsen等利用已经发表的实验数据，构建了黑曲霉基因尺度代谢网络，并通过实验数据以及代谢通量分析得以验证，并阐述了黑曲霉的代谢潜力。开放的BioMet Tool Box 2.0（http://www.biomet-toolbox.org/）集成了黑曲霉的多种组学数据，使黑曲霉的系统解析更加便捷。黑曲霉代谢和调控网络的构建为探索工业生产菌株发酵机理和通过分子生物工程手段改造菌株，提高工业生产菌株的性能提供了新的思路和方法。

黑曲霉是重要的工业发酵微生物，是美国食品药品监督管理局（FDA）认定的GRAS（generally regarded as safe）菌株之一，在有机酸、工业酶制剂生产方面应用广泛。黑曲霉用来生产的有机酸主要有柠檬酸、葡萄糖酸和没食子酸等，其中柠檬酸年产量超过160万吨，其中99%以上的柠檬酸都是通过黑曲霉发酵实现的；生产的酶制剂主要有糖化酶、淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶等30余种。糖化酶作为淀粉糖化剂，在谷氨酸、柠檬酸、啤酒和酒精等发酵产品的生产中作为处理原料的重要酶制剂，发挥着极其重要的作用。果胶酶主要应用在食品工业，用于果蔬汁饮料和果酒榨汁，可以很好地分解果胶，提高产品品质。由于黑曲霉自身能产生大量且丰富的酶系，因此也广泛应用于酱油酿造行业，对改善酱油风味和品质发挥了重要作用。此外黑曲霉出色的蛋白质分泌能力，使其被开发为异源蛋白表达的理想宿主。

3.米曲霉

米曲霉也是常见的曲霉，其菌落生长快（10d直径达5～6cm），质地疏松，初为白色或黄色，后转变为褐色至淡绿褐色，背面无色。米曲霉多为无性繁殖，产生分生孢子。分生孢子幼时呈梨形或卵圆形，成熟后多变为球形或近球形，直径4.5～7.0μm，粗糙或近于光滑（图3-14）。米曲霉分布非常广泛，主要存在于粮食、发酵食品、腐败有机物和土壤中。米曲霉可产生多种酶，除蛋白酶以外，还可产生淀粉酶、糖化酶、纤维素酶和植酸酶等。米曲霉广泛应用于食品、医药及饲料等工业中，是我国传统酿造食品酱和酱油的生产菌种，是美国FDA认定的GRAS之一。

由于在酿造工业中的重要应用，优良菌种的选育成为米曲霉研究的重要内容。经典的育种方法主要有物理化学诱变（如紫外诱变、亚硝基胍诱变、亚硝酸诱变等）和原生质体融合技术等，新发展的技术有基因组改组技术（genome shuffling）和代谢工程等。唐洁等对米曲霉AS 3.951和CICC 2339进行原生质体电融合育种，筛选到EF113和EF222两株融合菌，其酶活力分别达到7680U/g和7200U/g，远高于亲本菌株的酶活；潘力等对米曲霉沪酿3.042的8株突变株采用基因组改组技术筛选高蛋白酶活力菌株，通过2轮实验筛选出6株高产中性蛋白酶突变株，其中菌株FII-41的酶活达到7412U/g（干基），比原始出发菌株的酶活提高了1.76倍，且遗传稳定。随着分子生物学技术的发展，以及组学研究的日益广泛深入，出现了更多菌种改良的新方法和新策略。例如，对于那些生化代谢途径清晰的菌株，通过代谢工程策略可以更容易地选择菌种改良的靶点；而对那些生化代谢途径不清楚的菌株，也可以直接通过DNA重组、系统生物技术、核糖体工程和表观遗传修饰等手段进行遗传育种。这些新方法和新策略使得菌种选育工作具有定向性和趋向正突变的特点，极大地提高了菌种选育的效率。

作为真核生物表达系统，米曲霉表达系统具有以下优点：蛋白质分泌能力强；蛋白质翻译后修饰模式接近于高等真核生物，能高效实现蛋白质的肽链剪切、糖基化、形成二硫键、折叠成特定空间结构等。米曲霉营养要求低，易于繁殖生长，适于进行大规模、高密度培养，而且其发酵工艺及下游加工技术已逐步完善；米曲霉长期应用于食品及食品加工行业，是公认的GRAS菌株。由此可见，米曲霉是很有潜力的重组蛋白表达系统。

五、毛霉属

毛霉（Mucor）又称为黑霉、长毛霉，是接合菌门（Zygomycota），接合菌纲（Zygomycetes），毛霉目（Mucorales），毛霉科（Mucoraceae）真菌中的一个大属。毛霉的菌丝体发达，呈棉絮状，由许多分枝的菌丝构成，不产生定形菌落。毛霉菌丝无隔膜，有多个细胞核，在基物内外能广泛蔓延，无假根或匍匐菌丝。菌丝体上直接生出单生、总状分枝或假轴状分枝的孢囊梗。各分枝顶端着生球形孢子囊，囊内产大量球形、椭圆形、壁薄、光滑的孢囊孢子，孢子成熟后孢子囊破裂释放孢子（图3-16）。毛霉无性繁殖产生孢囊孢子，有性繁殖则产生接合孢子。

图3-16 毛霉的形态与结构示意

（1）单生孢囊梗；（2）假轴状分枝孢囊梗；（3）孢子囊结构

毛霉种类较多，在自然界中分布广泛，在土壤、空气中都有很多毛霉孢子。毛霉在生物工业中的主要用途是用来生产酸性蛋白酶。酸性蛋白酶与动物蛋白酶如胃蛋白酶及凝乳酶性质相近，因此常取代动物蛋白酶用于干酪和酱油的生产中。嗜热的毛霉菌株微小毛霉（Mucor pusillus）及米黑毛霉（Mucor miehei）是目前用于干酪生产蛋白酶的主要来源。在我国，毛霉长期应用于腐乳的制备中。大豆中的蛋白质在毛霉蛋白酶的作用下，水解为各种氨基酸而赋予腐乳以鲜味。与黑曲霉和米曲霉蛋白酶相比，毛霉蛋白酶水解蛋白的产物没有苦味，适口性好。毛霉的淀粉酶活力也很强，可把淀粉转化为糖，在酿酒工业中多用作淀粉质原料的糖化菌。另外，有的毛霉能产生草酸、乳酸、琥珀酸、脂肪酶和果胶酶等有机酸。

六、根霉属

根霉（Rhizopus）分类上属于接合菌门，接合菌纲，毛霉目，毛霉科。根霉的菌丝发达，无隔膜，有分枝和假根。营养菌丝产生弧形匍匐状菌丝，在培养基表面水平生长，在匍匐枝的节间形成特有的假根。假根起固定和吸收养料的作用。根霉无性繁殖产生孢囊孢子。在假根着生处，向上生出直立的孢囊梗，梗的顶端膨大为孢子囊，孢子囊内形成大量的孢囊孢子。孢囊成熟后，囊壁破裂，释放出孢子（图3-17）。根霉的有性繁殖产生接合孢子。

图3-17 根霉形态与结构示意

根霉广泛分布于酒曲、植物残体、腐败有机物和土壤中，能产生淀粉酶、糖化酶、脂肪酶、延胡索酸和乳酸等酶和有机酸，是工业上常用的生产菌种。常见的根霉菌种有黑根霉（Rhizopus nigricans）、华根霉（Rhizopus chinensis）、少根根霉（Rhizopus arrhizus）和米根霉（Rhizopus oryzae）。米根霉和华根霉可用于制曲和酿酒，它们所产的淀粉酶活力很强，是酿造工业中常用的糖化菌，同时又能合成众多芳香性酯类物质，能增加酿造产品的风味；黑根霉常用于生产果胶酶和木聚糖酶；少根根霉则广泛应用于生产L-乳酸等物质。