20世纪90年代后期，人们以碳水化合物为供氢体，直接以厌氧活性污泥为天然产氢微生物，通过厌氧发酵成功制备出了氢气。目前，生物发酵制氢主要分3种类型：纯菌种与固定化技术相结合，其发酵制氢的条件相对比较苛刻，现处于实验阶段；利用厌氧活性污泥对有机废水进行发酵制氢；利用高效产氢菌对碳水化合物、蛋白质等物质进行生物发酵制氢。

生物发酵制氢所需要的反应器和技术都相对比较简单，使生物制氢成本大大降低。经过多年研究发现，产氢的菌种主要包括肠杆菌属（Enterobacter）、梭菌属（Clostridium）、埃希氏肠杆菌属（Escherichia）和杆菌属（Bacillus）。除了对传统菌种的研究和应用之外，人们试图能寻找到具有更高产氢效率和更宽底物利用范围的菌种，但是在过去的10年间，鲜有报道新的产氢生物，生物发酵制氢量也没有明显的提高^[31-33]。

1.原理

生物发酵制氢过程，不依赖光源，底物范围较宽，可以是葡萄糖、麦芽糖等碳水化合物，也可以用垃圾和废水等。其中葡萄糖是发酵制氢过程中首选的碳源，发酵产氢后生成乙酸、丁酸和氢气，具体化学反应如下：

根据发酵制氢的代谢特征，将发酵制氢的机理归纳为两种主要途径：丙酮酸脱羧产氢，产氢细菌直接使葡萄糖发生丙酮酸脱羧作用，将电子转移给铁氧化还原蛋白，被还原的铁氧化还原蛋白再通过氢化酶的催化，将质子还原产生H₂分子，或者丙酮酸脱羧后形成甲酸，再经过甲酸氢化酶的作用，将甲酸全部或部分分裂转化为H₂和CO₂；NADH+H⁺/NAD⁺平衡调节产氢，将经过EMP途径产生的NADH+H⁺与发酵过程相偶联，其被氧化为NAD+的同时，释放出H₂分子，它主要作用是维持生物制氢的稳定性。

发酵细菌在产氢代谢过程中，由于所处的环境、生物类群不同，最终的代谢产物不同。根据代谢产物的种类，将生物发酵制氢分为丁酸型和丙酸型发酵制氢。

2.生物发酵制氢方法分类

传统的生物发酵制氢工艺有活性污泥生物制氢法、发酵细菌固定化制氢法；目前又研究出了生物发酵与微生物电解电池相结合的生物制氢法。

（1）活性污泥生物制氢法

活性污泥生物制氢法是利用驯化的厌氧污泥发酵有机废水来制取氢气。经过发酵后末端的产物主要为乙醇和乙酸。利用活性污泥生物制氢的设备工艺相对比较简单，成本较低，但是产生的氢气比较容易被活性污泥中混有的耗氢菌消耗掉，从而影响产氢效率。

我国在活性污泥生物制氢方面取得了一定的进展，2005年任南琪教授完成了世界上首例“废水发酵生物制氢示范工程”，采用的生物制氢装置（CSTR型）有效容积为65m³，日产氢能力为350m³，成功完成了与氢燃料电池耦合发电工程示范，日产氢量可以满足60～80户居民使用^[34]。

（2）发酵细菌固定化制氢法

在发酵制氢的研究中，人们为了增加细菌在反应器中的生物持有量，使发酵细菌有效地聚集起来，较高的细菌浓度可以使细菌的产氢能力充分发挥出来，通常利用细胞固定化技术。发酵细菌固定化制氢法是将发酵产氢菌固定在木质纤维素、琼脂、海藻盐等载体上，再将其进行培养，最后用于发酵制氢。研究表明，固定化细胞与非固定化细胞相比，能耐较低的pH值，持续产氢时间长，能抑制氧气扩散速率等。虽然固定化技术使单位体积反应器的产氢速率以及运行稳定性得到了很大提高，但是所用的载体对发酵细菌具有不同程度的毒性，载体占据的较大空间限制了产氢细菌浓度的提高，同时存在机械强度和耐用性差的缺点。

（3）生物发酵与微生物电解电池组合法

生物发酵与微生物电解电池可以结合起来提高总体系统的产氢量。首先通过生物发酵作用，细菌将木质纤维素等生物质转化为甲酸、乙酸、乳酸、乙醇、二氧化碳、氢气。然后通过微生物电解电池，再将酸类和醇类转化为氢气。这样的组合可以大大提高发酵制氢的产氢率^[35-37]。

3.生物发酵制氢工艺参数

影响生物发酵制氢反应器工艺运行的因素很多，例如温度、溶液的pH值、底物、水利停留时间等。

（1）温度(www.daowen.com)

温度影响生物发酵细菌产氢代谢的速度，不同发酵产氢细菌的产氢温度存在较大差异。研究结果表明，大部分发酵产氢菌属于嗜温菌，目前还没有常温发酵产氢菌的报道；而高温发酵产氢菌的报道也很少，最高的温度为55℃时，可以达到较好的产氢效果^[38-41]。

（2）pH值

溶液的pH值是影响生物发酵制氢工艺的重要参数之一，原因是pH值对细菌微生物的代谢会造成影响，直接影响到产氢微生物细胞内部氢化酶的活性、细胞的氧化还原电位、代谢产物的种类和形态、基质的利用性。大部分的研究报道表明，生物发酵微生物通常在弱酸性的条件下，可以发挥较高的产氢效率。pH值的高低直接影响到代谢的产物，当pH值较高时，发酵代谢产物以酸类为主，当pH值较低时，发酵代谢产物主要是酮类和醇类。乙醇型发酵最佳的产氢pH值为4.2～4.5，丁酸型的发酵最佳产氢pH值为6.0～6.5^[42，43]。

（3）底物

底物对生物发酵制氢效率的影响是很明显的，理论研究时所采用的底物通常有葡萄糖、蔗糖、淀粉、纤维素等，这些碳水化合物分子结构比较简单。而以有机废弃物作为底物的生物发酵制氢就变得非常复杂，废水的来源不同，底物的成分就会千差万别。对于利用有机废弃物进行生物发酵制氢，首先对这些成分复杂的废弃物进行预处理；使废弃物中的有机物可以或者易被产氢微生物所利用，通常的预处理方法有5种，即超声波振荡处理、酸处理、灭菌处理、冻融处理和添加甲烷菌抑制剂。研究结果表明，冻融和酸处理的产氢效果最好，其次是灭菌处理。底物中无机营养元素对发酵制氢菌细胞的生长是必需的，无机营养元素的添加可以直接影响生物发酵制氢的进程，例如Fe，作为细胞内酶活性中心的重要组成部分，可以维持生物大分子和细胞结构的稳定性，氢化酶的活性随着铁的消耗而下降；铁也是铁氧化还原蛋白的重要组分^[44]。

（4）水利停留时间

如果采用连续型发酵产氢装置，水利停留时间就成为很重要的影响因素。由于发酵制氢反应器的类型不同，水利停留时间会存在差异，通常情况下，水利停留时间为2～24h。

4.生物发酵制氢反应器

限制生物制氢工业化规模的主要因素是发酵制氢过程中较低的产氢率，按照目前的产氢能力，如果工业化的话，就需要一个超大体积的反应器。有研究表明，当利用生物发酵法，在室温条件下，氢气的产生速率为2.7L/h时，为小型质子交换膜燃料电池提供1kW电量的生物反应池的最小体积为198L^[45，46]。而处于实验规模的反应器，通常采用分批处理反应器，它具有容易操作和灵活等优点，而到目前为止，还没有建立起工业化规模的反应器。在德国，大部分的生物制氢反应装置通常为立式连续搅拌的反应槽，并附带各种类型的搅拌器。这种类型的反应器有一半多被单层或双层的膜所覆盖，用来保存生物质。如图3-5所示。

生物制氢技术尚不成熟，对微生物制氢的代谢机制的研究还不够深入，尽管在生物制氢菌种的筛选分离，以及反应器装置的研发上做了大量工作，但是生物制氢技术的应用还任重道远。

图3-5 厌氧发酵制氢反应器（a，b，c为垂直式全搅拌槽式反应器，其中a和b为机械搅拌，c为生物质混合；d，e为水平插流反应器，机械搅拌）^[47]

研究发现，光合细菌产氢的能量利用率比发酵细菌高，可以将产氢、光能利用、有机物的去除有机地结合在一起，使其成为最具潜在应用前景的方法之一。生物发酵细菌的产氢速率较高，其对外界条件要求较低，使其具备较好的应用前景。至目前为止，对藻类及光合细菌的研究要远多于对发酵产氢细菌的研究。传统的观点认为，微生物体内的产氢系统（主要是氢化酶）很不稳定，只有进行细胞固定化才可能实现持续产氢。

从国内外研究结果来看，生物质制氢的研究的困境主要体现在如下几个方面：

1）菌种的选择：天然厌氧微生物的菌种来源有限，大多来自于活性污泥；光合作用产生氢气的菌类的种类有限，筛选困难。

2）供氢体：生物质制氢的供氢体仍只局限于简单的碳水化合物。

3）菌种的固定化技术：尚无优良的包埋剂、菌种的包埋技术复杂、固定化细胞活性衰减快，更换周期变短，增加了运行成本。菌种细胞固定化之后形成的颗粒内部传质阻力较大，主要是产物在颗粒内积累，会对生物产生反馈抑制作用，从而降低了生物的产氢能力。同时固定剂会占据大量的空间，从而减少了生物的保有量，将直接影响产氢率的提高。

如果实现生物制氢工业，人们要在生物制氢机理的研究上、生物制氢菌种的筛选上以及生物制氢反应器的研究上都要有所突破。