光合细菌是能在厌氧光照或好氧黑暗条件下利用有机物作供氢体兼碳源，进行光合作用的细菌，而且具有随环境条件变化而改变代谢类型的特性。能够实现光生物制氢的微生物有3类：好氧型绿藻、蓝绿藻和厌氧型光合作用细菌。这些所谓的光氧生物将光作为能源，充分利用太阳能，进行只放氢不产氧活动。其中光合作用细菌比蓝藻和绿藻的产氢纯度和产氢效率要高。同时，光合细菌产氢条件温和，能利用多种有机废弃物作底物进行产氢，实现能源生产和废弃物利用双重效果，故光合细菌制氢被认为是未来能源供给的重要形式和途径。

Gaffron、Rubin和Spruit同时报道了利用光生物过程进行产氢和氧，就是利用太阳能和光合微生物进行有效产氢的过程^[18，19]。光合细菌产氢过程可以通过两种途径实现：去除全球温室气体CO₂，生成非污染的可再生的能源（通过绿藻和蓝细菌的生物光合作用）；利用对环境生态有害的废弃物作为底物（通过光合细菌的光发酵）。自从Gest首次证明光合细菌可利用有机物作为供氢体，实现光合作用放氢以来，光合放氢机制的研究始终是研究的热点和难点。日本、美国、欧洲的科研人员对此做了大量的研究，但光合放氢过程非常复杂而且精密性较高，目前的研究还主要集中在高活性产氢菌株的筛选、优化以及环境条件的选择上，目的是提高产氢量，研究水平和规模还基本处于实验室阶段。

与热化学和电化学制氢相比，光合生物制氢有很多局限性，产氢率很低。理论上，在直接生物光合作用的过程中，2mol水可以生成2mol氢气；在非直接的生物光合作用中，1mol葡萄糖中可以产生12mol氢气；在光发酵过程中，1mol乙酸中可以产生4mol氢气。但是实际的产氢率比最大的理论产氢率低得多，其原因是在藻类和蓝细菌中涉及产氢酶，如氢化酶和固氮酶，体系产生的氧气使其活性迅速降低。利用紫色光合细菌进行产氢的优势在于没有氧气的干预，但是氢化酶的吸收使整个过程的产氢率降低。

1.原理

光合微生物的生理功能和新陈代谢作用是多样化的，因此其具有不同的产氢路径。光合生物制氢路径如图3-4所示。蓝藻和绿藻通过直接和间接光合作用都可以产生氢气。

图3-4 光合生物制氢路径（包括好氧光合作用和厌氧光合作用两部分）^[20]

蓝藻和绿藻的直接光合作用产氢过程是利用太阳能直接将水分解生成氢气和氧气。在捕获太阳能方面显示出类似高等植物一样的好氧光合作用，其中包含两个光合系统（PSⅠ和PSⅡ）。当氧气不足时，氢化酶也可以利用来自铁氧化还原蛋白中的电子，将质子还原，产生氢气。在光反应器中，细胞的光合系统PSⅡ受到部分抑制会产生厌氧条件，因为只有少量水被氧化生成氧气，残余的氧气通过呼吸作用被消耗了。

化学反应式为

间接的生物光合作用是有效地将氧气与氢气分开的过程，尤其在蓝藻中最常见。存储的碳水化合物被氧化，而产生氢气。化学反应式为

在厌氧的黑暗条件下，丙酮酸盐铁氧化还原蛋白的氧化还原酶使丙酮酸盐失去碳酸基，乙酰辅酶A通过铁氧化还原蛋白的还原作用生成氢气。丙酮酸脱氢酶（PDH）会在丙酮酸盐的代谢过程中产生NADH，在阳光较少的地方，铁氧化还原蛋白被NADH所还原。固氮的蓝细菌主要通过固氮酶产生氢气（将N₂固定为NH₃），而不是通过有双向作用的氢化酶。然而在很多没有固氮的蓝细菌中，通过具有双向作用的氢化酶，也能观察到氢气的生成。(www.daowen.com)

两类主要的光合作用细菌有紫色细菌和绿色细菌，只利用一个光系统进行光合作用。绿细菌具有PSI型反应中心。无机/有机的底物被氧化，给出电子，通过FeS蛋白将铁氧化还原蛋白还原。对于暗反应以及产氢反应而言，被还原的铁氧化还原蛋白直接作为电子给体。相比较而言，紫色细菌含有类似反应中心的PSⅡ体系，它不能还原铁氧化还原蛋白，但是可以通过循环电子流产生ATP。固氮酶促成的氢气释放过程所需要的电子来自于无机/有机的底物。通过反应中心细菌叶绿素进入“苯醌池”。苯醌的能垒不足够负，去直接还原NAD⁺。因此，来自苯醌池的电子会被迫反过来还原NAD⁺为NADH。这个过程所需要的电子被称为逆电子流。在整个过程中并没有氧气的生成，所产生的氢气净总量受氢化酶活性的影响。有研究表明，在生物光合作用产氢方面，紫色细菌的光合作用被认为是最好的，因为紫色细菌可以利用工业废物和发酵过程的副产物（比如有机酸等）。

2.光生物反应器

为了提高生物制氢的产氢率，人们设计了各种光生物反应器。在光生物反应器中，光能被转化为生物化学能。光生物反应器区别于其他普通反应器的最基本的因素为：反应器是透明的，使光最大限度地透过；能源是瞬时的，不能存储于反应器中；细胞发生自身遮蔽。自身遮蔽导致额外吸收的能量发生损失，荧光和热会使温度升高，生物反应器需要附加冷却系统。反应器的厚度通常较小，从而增加反应器面积与体积比，避免细胞自我遮蔽的影响。

影响光生物反应器制氢效率的因素很多，为了提高光合生物的制氢量以及生物量，人们设计了多种生物反应器，在众多的反应器中，目前应用最多的是管状平板立柱式光生物反应器。各种光生物反应器都有各自的优缺点，比如在管式光反应器中，可以得到较大的光辐照面积，但是由于光合作用产生的溶解氧浓度较高以及泵输入的能量也较多，使这种反应器的规模化受到了限制。在立柱式的光生物反应器中，光的辐照面积较小，但是由于其形状小巧、价格低廉、容易操作以及可以用鼓泡的方法进行搅拌等因素，在微藻类和光合作用细菌进行制氢时，立柱式光生物反应器仍然得到了广泛应用。在平板式光反应器中，光合作用效率高、气压可控，与其他反应器相比成本低，但是其在制氢过程中，却很难保持培养温度的恒定以及适当的搅动^[21-25]。

除了光生物反应器的形状对制氢效率的影响之外，光生物反应器的物理化学参数也影响着氢气的产生，例如溶液的pH值、温度、光强、光穿透的深度、溶解氧、溶解CO₂、搅动、气体交换、碳源和氮源以及两者的比例等。光生物反应器是敞开的还是封闭的，将影响这些物理化学参数的设定。

限制生物法大规模制氢的主要因素是只有有限的光能透射进入反应器深处；外部光源通过光纤光缆被放入反应器的较深区域，并且使光源均匀分布。这种分散的光源对制氢起到关键的作用^[26-30]。

3.生物产氢酶

在生物制氢过程中，有两种主要的酶，即氢化酶和固氮酶，它们在生物产氢中起到催化的作用，将质子H⁺还原，生成分子H₂。这两种酶都属于金属蛋白。

1）氢化酶：生物所发生的一系列分解水产氢行为，都基于连续排列的具有催化功能的氢化酶亚单元；据研究，存在3种不同类型的氢化酶，即[NiFe]氢化酶、[FeFe]氢化酶和Fe-S氢化酶，其中Fe-S氢化酶后来被命名为[Fe]氢化酶；每种酶中都存在着具有特定功能的核。[FeFe]氢化酶的产氢量较高，而[NiFe]氢化酶的耐氧能力较强，[Fe]氢化酶不参与产氢行为。[Fe]氢化酶通过H₂将CO₂催化还原为甲烷，依赖这种酶的细菌大部分都是产烷生物。

2）固氮酶：固氮酶对于农业生产是非常重要的，因为通过固氮作用，可以将大气中的N₂转化为NH₃，为土壤进行了自然施肥。固氮酶主要进行固氮的同时，也能产生氢气。研究发现，在氮气有限的条件下，固氮酶能产生较多的氢气。

生物产氢酶在生物制氢过程中起到重要的作用，但是研究发现大部分的生物产氢酶都会对氧气非常敏感。在分解水产氢的过程中，氧气的产生是不可避免的，于是生成氢气的连续性就会受到影响。目前为止只有少数的氢化酶表现出对氧气的耐性，人们也尝试了很多办法去培育能对氧耐受的变异体。据观察，海藻氢化酶是最小最简单的氢化酶，其对氧失活最敏感，由于只有活性位点所在的H组编码，所以海藻氢化酶对氧失活更敏感一些。而F组编码可以保护活性位点，避免其发生氧气失活。H组的氨基酸顺序或者活性位点区域的氨基酸成分是非常关键的，直接关系到其对活性位点的保护，避免受到氧气的影响。

固氮酶对氧气也敏感，但是与氢化酶相比，其对氧气的敏感性要相对小一些。固氮酶主要存在于厌氧的原核生物中，也存在于蓝细菌中。通过异核细胞，厌氧氢的产生与好氧光合作用隔离开来。在氮气有限的条件下，有利于氢的产生，同时氢的产生是一个高耗能的过程。