1 范围

本标准规定了微生物源酶制剂抗菌活性的测定方法。

本标准适用于用微生物生产的酶制剂抗菌活性的测定。

2 设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

2.1 生物安全柜。

2.2 冰箱：2℃～5℃。

2.3 恒温培养箱：36℃±1℃。

2.4 恒温水浴箱：46℃±1℃。

2.5 天平：感量为0.1g。

2.6 振荡器。

2.7 无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。

2.8 无菌培养皿：直径90mm。

2.9 无菌锥形瓶：容量250mL、500mL。

2.10 pH计或精密pH试纸。

2.11 无菌纸片：见A.8。

2.12 无菌镊子。

2.13 游标卡尺：刻度为0.1mm。

3 培养基和试剂

3.1 胰蛋白胨大豆琼脂（Tryptone Soy Agar，TSA）：见A.1。

3.2 胰蛋白胨大豆肉汤（Tryptone Soy Broth，TSB）:见A.2。

3.3 平板计数琼脂（Plate Count Agar）:见A.3。

3.4 0.1mol/L HCl:见A.4。

3.5 无菌生理盐水：见A.5。

3.6 50.0μg/mL环丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）溶液：见A.6。

3.7 5.0μg/片环丙沙星纸片：见A.7。

4 试验菌株

4.1 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 6538。

4.2 大肠埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC 11229。

4.3 蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）ATCC 2。

4.4 环状芽胞杆菌（Bacilluscirculans）ATCC 4516。

4.5 化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）ATCC 12344，

4.6 粘质沙雷菌（Serratia marcescens）ATCC 14041。

5 检验程序

微生物源酶制剂抗菌活性的测定检验程序见图1。

图1 微生物源酶制剂抗菌活性的测定检验程序

6 操作步骤

6.1 试验菌悬液原液制备

将金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、大肠埃希氏菌（ATCC 11229）、蜡样芽孢杆菌（ATCC 2）、环状芽孢杆菌（ATCC 4516）、化脓性链球菌（ATCC12344）、粘质沙雷菌（ATCC 14041）冻存菌株分别接种于盛有5mL TSB的试管，置36℃±1℃培养18h～24h进行第一次传代培养，分别挑取第一次传代培养液1～2环转种于5mL TSB肉汤，置36℃±1℃培养18h～24h进行二次传代培养，作为试验菌悬液原液备用。

试验菌悬液原液纯度检测：分别挑取试验菌悬液原液各一环，划线接种于TSA平板，36℃±1℃培养20h～24h，观察纯度。

6.2 菌悬液原液浓度测定

6.2.1 菌悬液原液稀释

分别取6.1中制备的菌悬液原液依次进行十倍梯度稀释，蜡样芽孢杆菌和环状芽孢杆菌分别制成10^-4稀释液，金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、化脓性链球菌、粘质沙雷菌分别制成10^-5稀释液。

6.2.2 培养计数

分别吸取6.2.1中制备好的各菌稀释液1mL于无菌平皿内，每个稀释度做两个平行，并用无菌生理盐水作空白对照。向平皿中倾注冷却至46℃左右（可放置于46℃±1℃的恒温水浴箱中保温）的平板计数琼脂15mL～20mL，并转动平皿使其混合均匀。待琼脂凝固后，将平板翻转，于36℃±1℃培养24h后计数，各菌悬液原液中菌浓度均大于10⁶CFU/mL时方可使用。

6.3 检测平板制备

倾注融化并冷却至46℃±1℃的TSA培养基15mL于无菌培养皿内，待其凝固后制成TSA平板，备用。

将6.1中二次传代后的各菌培养物分别用冷却至46℃±1℃的TSA培养基按1∶10的比例稀释（其中化脓性链球菌ATCC 12344按1∶20的比例稀释），充分混匀后各取10mL至上述已制备好、于46℃±1℃中保温的TSA平板内，轻轻摇动平板使菌液均匀铺平，待其凝固后制成检测平板，备用。

注：为防止含菌培养基遇到TSA后马上凝固，引起菌悬液铺板不均匀，菌悬液铺板前应事先将TSA平板置于46℃±1℃条件下保温平衡10min。

6.4 酶制剂纸片的制备

准确称（移）取1.0g（mL）酶制剂于9mL无菌生理盐水中，充分混匀后制成10%的酶制剂溶液。将无菌纸片放入无菌平皿内，在每张纸片上缓缓滴加100μL 10%的酶制剂溶液，使其全部吸收，每种酶制剂样品制备12张纸片。

6.5 贴纸片及培养

将6.4中制备的含待测酶制剂的纸片、含环丙沙星的阳性对照纸片（见A.7）和含100μL无菌生理盐水的空白阴性对照纸片用无菌镊子分别置6.3中制备的检测平板上，每个平板贴2张纸片（2张含待测酶制剂的纸片或2张含环丙沙星的纸片或2张空白纸片），两纸片圆点的间距大于32mm，每个标准菌株分别设一阳性对照和一阴性对照平板。将平板正置于4℃±0.5℃冰箱内过夜（12h～16h）。第二天转入36℃±1℃恒温培养箱中培养24h后，测定酶制剂样品、环丙沙星和阴性对照纸片形成的抑菌圈。

7 抗菌活性结果报告

7.1 结果判定

若待测酶制剂对3种或3种以上受试微生物呈现出抗菌活性，即纸片周围出现清晰可见的抑菌圈（每个抑菌圈直径≥16mm），且阳性对照环丙沙星纸片对金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、粘质沙雷菌、环状芽孢杆菌、化脓性链球菌5种细菌形成的抑菌圈均＞16mm，则判定该酶制剂样品中存在抗菌活性物质。

7.2 结果报告

报告样品中检出抗菌活性或未检出抗菌活性。(www.daowen.com)

附录A培养基与试剂

A.1 胰蛋白胨大豆琼脂（Tryptone Soy Agar，TSA）

A.1.1 成分

胰蛋白胨　15.0g

大豆蛋白胨　5.0g

氯化钠　5.0g

琼脂粉　15.0g

蒸馏水　1000mL

A.1.2 制法

将上述各成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH至7.2±0.2，分装至锥形瓶中，121℃灭菌15min。

A.2 胰蛋白胨大豆肉汤（Tryptone Soy Broth，TSB）

A.2.1 成分

胰蛋白胨　15.0g

大豆蛋白胨　5.0g

氯化钠　5.0g

蒸馏水　1000mL

A.2.2 制法

将上述各成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH至7.2±0.2，分装试管，121℃灭菌15min。

A.3 平板计数琼脂（Plate Count Agar，PCA）

A.3.1 成分

胰蛋白胨　5.0g

酵母浸膏　2.5g

葡萄糖　1.0g

琼脂　15.0g

蒸馏水　1000mL

A.3.2 制法

上述各成分加于蒸馏水中，煮沸溶解，调节pH至7.2±0.2，分装至锥形瓶中，121℃灭菌15min。

A.40.1mol/L HCl

A.4.1 成分

HCl　9mL

蒸馏水　991mL

A.4.2 制法

移取浓盐酸9mL（质量浓度为36%，密度为1.17g/m³），用无菌蒸馏水稀释至1000mL，0.22μm微孔滤膜过滤除菌后备用。

A.5 无菌生理盐水

A.5.1 成分

氯化钠　8.5g

蒸馏水　1000mL

A.5.2 制法

称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水，121℃灭菌15min。

A.650.0μg/mL环丙沙星（Ciprofloxacin，CIP）

A.6.1 成分

1000μg/mL环丙沙星　0.5mL

无菌生理盐水　9.5mL

A.6.2 制法

按产品说明书（百分比，含水量或效价）称取一定质量的环丙沙星用适量0.1mol/L HCl溶解使其浓度为1000μg/mL，无菌条件下0.22μm微孔滤膜过滤后移取0.5mL，用无菌生理盐水稀释至10mL，混匀。

A.75.0μg/片环丙沙星纸片（Ciprofloxacin paper，CIP paper）

A.7.1 成分

50.0μg/mL环丙沙星　100μL

无菌纸片　1张

A.7.2 制法

吸取50.0μg/mL环丙沙星溶液100μL缓慢均匀滴加于无菌纸片上，制成5.0μg/片环丙沙星纸片。

A.8 无菌纸片

A.8.1 要求

纸片外观应整洁、无毛边，无明显变形，无破损，pH为中性，厚度0.3mm～0.6mm，60s内吸收100μL蒸馏水。

A.8.2 制备及储存方法

制成标准直径为13.0mm±0.1mm的圆形纸片，置玻璃容器内，密封，121℃灭菌15min后，80℃±5℃干燥4h，备用。