定向固定化技术是指把酶和载体在酶的某些特定位点进行连接，使酶在载体表面按一定方向排列。该技术是在背离活性中心入口的酶表面，通过定点突变在该酶表面引入低频氨基酸（半胱氨酸），通过该氨基酸残基的特殊侧链来控制固定化方向。定向固定化酶的活性要远远高于随意固定化酶。Huang等通过定点突变在枯草蛋白酶分子表面远离活性中心的位置引入半胱氨酸（Cys）残基。经蛋白质空间折叠后暴露出Cys，然后利用Cys残基上的巯基固定枯草芽孢杆菌蛋白酶分子，取得了较好的固定效果，固定化效率和固定后催化活性均有很大提高。

Spitznagel等用碘乙酸活化多孔玻璃珠来定向固定抗体酶（abzyme）48G7-4A1的Fab′片段，抗体酶Fab′片段保持了很好的催化活性[k_cat=20.0；K_m（μm）=520]。抗体分子Fc区的糖链部分氧化可产生醛基，醛基与载体上的氨基通过缩合反应可实现定向固定化。与随机固定化相比，定向固定化后抗体稳定性提高的同时免疫吸附活性也提高了3倍。

目前，定向固定的方法有氨基酸置换法、抗体偶联法、酶与金属离子连接和多酶共固定法等。

（1）氨基酸置换法 利用基因定点突变技术在蛋白质分子表面合适位置替换一个氨基酸残基，通过该氨基酸残基特殊的侧链基团控制固定方向。半胱氨酸为低频氨基酸，在蛋白质分子中的出现频率约为2%，其巯基可以与载体的碘乙酰基团发生烷基化反应。(www.daowen.com)

（2）抗体偶联法 多数抗体具有足够的稳定性，可承受各种活化与偶联处理。抗体分子中有很多可供偶联的官能团，可以通过赖氨酸的ε-氨基或末端氨基、天冬氨酸的β-氨基、谷氨酸的γ-氨基或末端羧基进行一般性的偶联。抗体的二硫键还原后形成的半分子也可以提供远离抗原结合位点的巯基作为偶联位点。

（3）酶与金属离子连接 金属螯合载体可以和蛋白质表面供电子的氨基酸，如组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯醇基以配位作用方式紧密结合。Schmid等将螯合剂次氮基三乙酸共价结合在亲水性石英上，然后再连上二价金属离子（Ni²⁺），螯和剂—金属离子复合物上的自由协调位点可以和供电子基团如组氨酸连接。这样就可以通过金属离子镍将蛋白质和载体连接在一起。编者课题组采用自制的镍离子螯合环氧载体（Ni-E）固定化极端嗜热菌海栖热袍菌所产耐高温木聚糖酶XynB，酶活力回收率达65%。Ni-E固定化XynB与游离酶相比，pH稳定性有所提高，固定化酶的最适温度提高到100℃，温度稳定性较游离酶也有所提高。

（4）多酶共固定技术 有时为了发挥不同酶的不同催化作用，可以将不同的酶或细胞固定化于同一载体上。Atia将多孔乙醛酸琼脂表面的醛基用聚乙烯亚胺的氨基覆盖，形成惰性载体，将环己酮单加氧酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶共同固定，充分利用协同作用，提高催化效率。