基于定点突变的酶分子设计是指在酶结构的关键部位，如酶与底物的结合部位，对酶的个别氨基酸残基进行改造。因其对蛋白质整体改造范围较小，不容易引起蛋白质的错误折叠和稳定性降低，这种方法是目前使用最广泛的理性设计方法。一般地，这种方法的流程如图7-12所示，首先通过各种方法来获得尽可能详细的目标酶分子结构与相应的生物化学功能信息。这主要包括利用X射线晶体衍射、核磁共振（NMR）、冷冻电子显微镜三维重建或计算机建模等方法和手段获得目标酶的空间结构，并利用生物信息学、生物化学、生物物理学实验，确定酶与底物的结合部位、催化机制、热稳定性机制、耐酸碱机制等。在上述信息准确并尽可能完整的基础上，根据蛋白质化学和酶学的基本原理，确定酶结构中的特定氨基酸残基及其在酶的物理化学性质中所起的作用，并根据研究目标，针对特定的氨基酸设计突变体。利用分子生物学技术，尤其是目前已经非常成熟的定点突变技术，完成特定氨基酸突变体基因的表达与纯化，并对突变体酶的性质变化进行表征。

图7-12 酶分子理性设计的流程

该种方法的试验结果可以反馈并指导理性设计步骤。如果最终突变体的性质与目标设想一致，说明之前对于该氨基酸残基与酶功能之间的关联推测正确；反之，则说明对于酶的结构或者酶学实验结果需要进一步确认，并需对二者之间的关联进行重新考虑。这样经过多轮反复的验证和修正，可以帮助完善酶的结构和性质之间的关系，并对目标酶进行更精细的设计，直到最终获得具有所需性质的突变酶。

编者课题组（2017）研究米黑根毛霉GH17家族β-1，3-葡聚糖基转移酶催化中心的结构，发现Tyr102、Trp157和Glu158可以与底物糖链中+1和+2位的葡萄糖残基发生相互作用并稳定产物，如图7-13所示。因此设想突变去除如Glu158的侧链，即可以消除其侧链上O^ε2与糖链形成的氢键，从而削弱产物在催化中心的停留而加速反应的进行。

图7-13 米黑根毛霉来源β-1，3-葡聚糖基转移酶催化中心结构

注：右图为糖链在催化中心的空间排布，左图为催化中心中+1、+2位点葡糖残基与氨基酸残基的相互作用。

通过定点突变将Glu158突变为Ala、Lys、和Gly后，都会导致O^ε2的去除，如图7-14所示，从而削弱产物在该酶活性中心的停留时间而加快反应速率。以上突变分别使该酶水解β-1，3-葡聚糖的酶活力提高了350倍、46倍和9倍。

图7-14 米黑根毛霉来源β-1，3-葡聚糖基转移酶催化中心Glu158突变设计

目前常用的定点突变方法有寡核苷酸引物介导的定位突变、重组PCR介导的定位突变及盒式突变等。

1.寡核苷酸引物介导的定位突变(www.daowen.com)

寡核苷酸引物介导的定位突变的原理是用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制。该方法包括Kunkel突变法、基于抗生素的“抗性恢复”突变法和基于去除特定限制酶切位点的突变法等。

寡核苷酸引物介导的定位突变法的优点是保真度比重组PCR突变法高，缺点是操作环节复杂、周期长，而且在克隆待突变基因时会受到限制性酶切位点的限制。此外，寡核苷酸引物介导的定位突变常产生突变效率低的现象，其主要原因是大肠杆菌中存在甲基介导的碱基错配修复系统。针对这一问题，最近的研究进展为：①采用甲基修复酶缺乏的菌株作为受菌体，大大降低了突变修复频率；②采用改进后的质粒，省去了制备单链模板的烦琐步骤，节省了时间；③增加了多个抗生素筛选标志和相应的多对敲除修复引物，使得在该质粒上可以连续进行不止一次的突变反应，使突变反应更加快速、简便。

2.聚合酶链式反应（PCR）介导的定位突变

聚合酶链式反应（PCR）介导的定位突变法是重组PCR的一种。这种技术能够在DNA编码序列的任一位置引入点突变，插入和缺点突变序列，从而改善酶的性质与功能。基本原理是利用PCR将插入和缺失的突变碱基均设计在引物中，先用两对引物分别对核酸进行PCR扩增，通过重叠延伸产生带有部分重叠序列的两个PCR引物，这些产物经过混合、变性、复性和链延伸后，再用一对与两个待接片段外侧互补的引物进行第二次扩增，从而产生出全长的异源杂合双链DNA。PCR的出现推动了定位突变的发展，以PCR为介导的定位突变为基因修饰和改造提供了另一条途径。其优点是操作快捷简单，不受限制性内切酶识别位点的限制，突变的成功率可达100%，还可以在所设计的引物5′端加入合适的限制性内切酶位点，为PCR扩增产物后续的克隆提供方便。但也存在两个缺点：①后续工作比较复杂，PCR扩增产物通常需要连接到载体分子上，然后才能对突变的基因进行转录和翻译；②Taq DNA聚合酶的保真性偏低，因此PCR方法产生的DNA片段要经过核苷酸序列测定，方可确证有无发生其他突变。

3.盒式突变

盒式突变（cassette mutagenesis）也称片段取代法（DNA fragment replacement），是一种区域性定位突变方法。它是1985年由Wells提出的一种基因修饰技术，可经过一次修饰，在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，从而对蛋白质分子中某些重要氨基酸进行“饱和性”分析，大大缩短了“误试”分析的时间，加快了酶工程的研究速度。这一方法的要点是利用目标基因中所具有的适当限制性内切酶位点，用具有任何长度、序列的DNA片段来置换和取代目标基因上的一段序列。这样人们不仅可以通过改变几个氨基酸序列，也可以通过改变一段DNA序列而产生嵌合蛋白质。要进行盒式突变，需要解决一个关键问题，就是在目标基因序列中，要有适当的限制性内切酶位点，使得用于取代野生型DNA序列的盒式突变序列可以有效地插入到目标基因中。然而，对于一个野生型蛋白质基因而言，其所含可供利用的限制性内切酶位点很少，为了在目标基因的特定位置中产生合适的酶切位点，可以利用遗传密码的兼并性，在不影响氨基酸序列的前提下，通过改变某些核苷酸的序列，产生合适的限制性内切酶位点。寡核苷酸引物介导的定位突变和PCR介导的定位突变都可以有效地解决这一问题。对于人工合成的基因而言，在合成的设计阶段，就要设计好合适的限制性内切酶位点，便于盒式突变的操作。

盒式突变可以利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。这种突变的寡核苷酸由两条寡核苷酸组成，当它们退火时，按设计要求产生克隆需要的黏性末端，由于不存在异源双链的中间体，因此重组质粒全部是突变体。如果将简并的突变寡核苷酸插入到质粒载体分子上，在一次试验中便可以获得数量众多的突变体，大大减少了突变需要的次数。盒式突变法具有简单易行、突变效率高等优点，还可以在一对限制酶切位点内一次突变多个位点，但缺点是合成多条引物的成本较高。

酶的理性设计与非理性设计各有优缺点，两种技术相互补充。即使有了大量有关结构与功能方面的知识，非理性进化也可以有效地增加理性设计的知识，为实施更理性的蛋白质设计提供关键的信息。根据这些信息可以缩减未来随机突变的序列空间或为更理性的定点突变提供突变目标。反过来，理性设计可以引入关键残基和结构元件，增加DNA改组过程中有益突变的重组频率，增加酶的进化过程。理性设计与非理性设计都可以非常有效地对酶进行改造，将二者结合起来改造酶特性将代表着未来的发展方向。