（一）DNA改组的概念

DNA改组（DNA shuffling）又称DNA洗牌，是基因在分子水平上进行的体外同源重组，因此又被称为有性PCR或有性进化（sexual PCR，或sexual evolution）。该技术是将一群密切相关的DNA序列，在DNaseⅠ作用下，随机酶切成许多片段，这些小片段之间有部分重叠的碱基序列，通过自身引导PCR（self-priming PCR），使这些小片段重新组装成全长基因，从而建立分子多样性突变文库，下一步是对突变文库进行筛选，直到获得性状较为满意的突变体。在理论和实践中，它都优于“重复寡核苷酸引导的诱变”和“连续易错PCR”，通过DNA改组，不仅可加速积累有益突变，而且可使酶的两个或者更多的已经优化的性质集于一身。在DNA改组过程中能以较低的和可以控制的几率引入点突变，同时它允许发生单一突变和较大的DNA片段的突变。而DNA改组的两个主要的缺点为：①非改组背景克隆子容易恢复成亲本克隆子；②亲本基因序列的同源性要求较高（常常不小于90%）。现已发展有家族改组以及使用单链DNA作为改组模板的DNA重组技术，以弥补传统DNA改组方法的缺点。

当DNA改组用于一组同源基因时，这种技术称为DNA家族改组（family shuffling）。利用基因家族之间的同源序列进行DNA重组，可实现同源重组，所获得的突变重组基因库既体现了基因的多样化，又最大限度地排除了那些不必要的突变。这种策略拓宽了酶分子突变库中的序列空间，而且由于限制了有害突变的掺入，并没有增加突变库的大小和筛选难度，从而保证了对很大的序列空间中有希望的区域进行快速定位。Stemmer等（1998）从4种微生物中选择编码头孢菌素酶的4个同源基因，对它们进行单独进化或者同源重组进化，来对两种进化模式进行比较。单基因改组后进化的突变酶，相对于各自独立突变进化的酶而言，对头孢羟羧氧胺的抗性增加了大约8倍；而用家族同源重组进化的方法使4个同源基因同时改组的话，抗性比独立进化的酶提高了270～540倍。

（二）外显子改组的概念

外显子改组（exon shuffling）类似于DNA改组，两者都是在各自含突变的片段间进行交换，前者尤适用于真核生物。与DNA改组不同，外显子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动，而DNA改组不受任何限制，发生在整个基因片段上。各种基因的外显子重新组合，可以由非同源组外显子产生，并进化成具有新功能的基因，内含子将加速新组合生成，加速蛋白质的进化速率。真核生物基因的内含子—外显子结构使外显子的重组可以由插入的内含子顺序的重组产生，从而获得具有功能改变的重排基因，基因组进化的这种模型称为外显子改组。

在自然界中，不同分子的内含子间发生同源重组导致与不同外显子结合，是产生新蛋白质的有效途径之一。外显子改组的自然过程可模拟应用嵌合寡核苷酸扩增，编码结构域的外显子或外显子组合。然后这些PCR片段的混合物应用自我引物重叠聚合酶反应组合组装成全长基因，当一个基因的外显子与另一个基因的外显子连接时，发生重组。构建外显子改组库有几种方式（表7-4），高质量的库是通过改组编码结构域的外显子构建的，这样只获得少数的交换体并保持大部分连接信息；还有另一种相反的方式，通过完全变更外显子构建蛋白质库，结果形成低平均功能库，但可以产生较为稀有的高新组合。

表7-4 外显子改组库的类型及区别

蛋白质数据库研究表明，外显子改组是新基因起源的普遍机制。因此，体外模拟体内外显子改组将是酶定向进化的普遍应用方法。

（三）DNA改组的方法

有性进化比无性进化体现出更多优势：①有性进化可以更快地组合有益突变，加快进化速度；②有性进化可以创造更大的多样性，以更好地适应变化的环境；③有性进化可以清除轻微有害突变，从而保证基因不会陷入渐进式的退化中。Willem Stemmer于1994年首先提出了DNA改组的思想，并将LacZ α用DNaseⅠ进行消化得到了10～70bp大小的随机片段集合，在不加入引物的情况下，利用PCR得到了全长的LacZ α产物，从而验证了体外PCR中存在着基因重组的现象。

常规的DNA改组实验包含下列步骤（图7-10）：①将要进行重组的一组母本DNA序列，往往是多个同源序列或者同源基因进行混合，并通过DNA酶（DNaseⅠ或者多种内切酶）处理产生一系列随机DNA片段；②在没有引物的情况下，将以上片段在适当的PCR条件下进行扩增，随着循环数的增加，PCR产物将越来越接近切割前目标基因的长度；③用基因两侧的引物合成全长的基因文库，克隆到载体上并转入宿主（如大肠杆菌、噬菌体）中进行表达；④在特定的选择压力下，选择目标性状改良的突变体，并将达到预期性状的突变体混合在一起作为下次DNA改组的模板。

图7-10 DNA改组流程图

注：多个同源基因或序列（不同条纹表示）被内切酶片段化后，在没有引物的情况下进行PCR形成嵌合文库，再对有益组合进行筛选得到目标片段。

基于上述DNA改组方法，Frances Arnold于1998年发明了另一套DNA有性PCR技术，被称作交错延伸法（staggered extension process，StEP）。其原理是：在用PCR同时扩增多个模板序列时，合成在目标基因两侧的引物。引物先在一个模板链上延伸，随之进行多轮变性和短暂的复性—延伸循环。每次循环中，被延伸的片段在复性时与不同的模板配对，并延伸一段非常短的距离。在每一循环中，不断延长的片段根据序列的互补性与不同模板退火，并进一步延伸，不断重复直到全长序列形成。由于模板的转换，大多数产生的新DNA分子中间隔含有不同亲本的序列信息，因此含有大量的突变组合。StEP与DNA改组在技术上类似，StEP重组发生在单一试管中，无需分离亲本DNA和产生的重组DNA，省略了用DNA内切酶切割的过程，它采取的是一种在复制过程中不断变换模板的机制，这正是逆转录病毒所采用的进化过程。该法简便且有效，为酶的体外定向进化提供了又一强有力的工具。

DNA改组能尽可能地把亲本基因群中的优势突变组合在一起，获得最佳突变组合，最终使酶分子的某种性质或功能得到进一步进化，或是得到两个或更多的已优化性质或功能的组合，或是实现目标蛋白多种特性的共进化。DNA改组的这种特性，常常与易错PCR联用，对目标基因进行多轮定向进化。在易错PCR中，通常有益突变的比例都远远低于不利突变，因此在定向进化时，每一轮常常最多只能鉴定出一个有益突变比较明显的突变体，进而作为母本进行下一轮进化。想要得到符合预期的有益突变体，就需要多轮连续的进化。但DNA改组存在一轮重组中将多种有益突变集合到一个基因里的可能，从而在接下来的筛选中一步得到符合预期的突变，大大加快了进化的历程。DNA改组技术已广泛应用于新酶特性的改进与创新上，在提高酶活力、热稳定性、底物特异性、对映体的选择性及可溶性表达和表达水平等方面都已取得了不少的成功结果。

以定向进化β-1，3-1，4-葡聚糖酶（PtLic16A）为例，编者课题组（2011）采用了DNA改组的方法来扩大基因文库，其中包括DNA随机片段化、重叠延伸PCR和全长基因的PCR扩增三个步骤。

（1）DNA随机片段化 包括利用DNaseⅠ对易错PCR扩增产物PtLic16A-m进行酶切处理，实现其随机片段化。DNaseⅠ酶切体系（100μL）:40mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）、8mmol/L Mg²⁺、0.67mmol/L Mn²⁺、5mmol/L DTT、8μg PtLic16A-m、0.02U DNaseⅠ。DNaseⅠ酶切条件为：20℃反应15min，加入2.5mmol/L EDTA终止反应，在80℃保温10min以灭活DNaseⅠ。利用2%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，采用以上条件进行DNaseⅠ处理得到的DNA小片段长度为40～60bp。DNA片段经过酚/氯仿/异戊醇（25∶24∶1）以及氯仿/异戊醇（24∶1）两步抽提纯化后，加入2.5倍体积无水乙醇和1/10体积醋酸钠（3mol/L醋酸钠，pH为5.2）沉淀，70%乙醇清洗两次，风干后溶于10μL双蒸水，得到DNA小片段PtLic16A-m/DNase Ⅰ。

（2）重叠延伸PCR 以步骤（1）中得到的DNA片段PtLic16A-m/DNaseⅠ为模板，进行无引物重叠延伸PCR，得到重叠延伸PCR扩增产物。重叠延伸PCR体系（50μL）：1x Pfu DNA聚合酶缓冲液、0.2mmol/L dNTP、1.5mmol/L MgSO4、8μL（约2μg）模板、1U Pfu DNA聚合酶。重叠延伸PCR条件：95℃，5min；95℃，30s、45℃，30s、72℃，1min+5s/循环（第一个循环为1min，之后每个循环比前一个循环增加5s），30个循环；72℃，8min。

（3）全长基因的PCR扩增 以步骤（2）中的重叠延伸PCR扩增产物为模板，用PtLic16A-F和PtLic16A-R进行全长基因PCR的扩增，得到全长PCR扩增产物。全长基因PCR扩增体系（50μL）: 0.2mmol/L dNTP，1.5mmol/L MgSO₄，0.2μmol/L PtgluF，0.2μmol/L PtgluR，1μL（50～100ng）模板，1U Pfu DNA聚合酶。全长基因PCR扩增条件：95℃，5min；95℃，30s、55℃，30s、72℃，2min，30个循环；72℃，8min。这样就得到了含有大量随机突变，同时又保留了母本中优秀性状的DNA片段。(www.daowen.com)

将上述易错PCR和DNA改组得到的DNA片段构建到原核表达载体pET-26b，再转化到大肠杆菌即得到随机突变表达文库，具体步骤如下所述。

（1）用限制性内切酶BspHⅠ和XhoⅠ双酶切上述得到的葡聚糖酶基因PtLic16A随机突变基因，并回收酶切产物。

（2）用限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ双酶切pET-26b（+）载体，回收载体骨架（约5230bp）。

（3）将步骤（1）的酶切产物和步骤（1）的载体骨架链接（其中BspHⅠ和NcoⅠ是同尾酶），利用酚/氯仿/异戊醇纯化并用乙醇沉淀得到连接产物，利用电转化法转化大肠杆菌BL21（DE3）细胞。收集所有的转化子，即为突变体表达文库。

从本质上讲，定向进化和自然进化的基本策略一致，都开始于随机突变和基因重组，并筛选新基因。定向进化和自然进化的不同在于：自然进化的驱动力来自于保守突变，突变率低、周期长，往往需要几年甚至几百万年的时间，以有机体更好地适应生存环境为筛选条件；定向进化中采取的突变和重组技术为非保守突变技术，可以迅速明显地改变基因产物的性状，只需要几周甚至几天就可以获得满意的结果，以人为制造的筛选条件为进化方向。

得到了具有足够大样本的突变体表达文库后，就需要利用一种特异性较高的、人为制造的筛选条件将符合预期性状的突变体筛选出来。在上述研究中，定向进化和DNA改组的主要目的是为了得到可以在酸性条件下高效水解β-葡聚糖的β-1，3-1，4-葡聚糖酶。因此，将上述所得的突变体文库利用大麦β-葡聚糖/刚果红平板法，根据β-1，3-1，4-葡聚糖酶水解平板中的大麦β-葡聚糖产生透明圈的原理进行阳性克隆的高通量筛选，实验步骤如下所述。

（1）将上述利用DNA改组产生的突变体表达文库适当稀释后均匀涂布于含相应抗生素的LB平板上，37℃培养24h。

（2）待（1）中LB平板上长出适当大小的菌落时，对每个菌落进行编号，并用灭菌的牙签转移至筛选平板（含有0.5%的大麦β-葡聚糖、1mmol/L IPTG和50mg/L对应的抗菌素的LB平板），37℃培养1d；原平板继续于37℃培养，以便以后挑取阳性突变体菌株。

（3）将步骤（2）中的筛选平板在37℃下培养1d后，移至60℃放置30min，使细胞裂解并与筛选平板上的底物充分反应，然后用质量分数为0.1%的刚果红溶液染色15min，再用1mol/L NaCl水溶液洗去刚果红，选择透明圈比对照组较大的菌落[图7-11（1）]，通过透明圈的位置及平板上的相应编号从原平板上挑取相应菌株，进行下一步的复筛。

（4）复筛时，挑取初筛为阳性的克隆接种至液体LB摇瓶培养基中，进行重组酶的诱导表达。取相同培养时间和培养条件的各个菌株发酵液，8000g冷冻离心10min，菌体利用50mmol/L磷酸缓冲液重悬，超声波破碎后离心取上清液，即为粗酶液。

（5）测定粗酶液分别在pH 5.0和pH 7.0条件下的酶活力，测定温度为70℃。所用缓冲液为：柠檬酸缓冲液（pH 3.0～5.5），MES缓冲液（pH 6.0～7.0）。以酸力条件下（pH 5.0）酶活力高于中性条件下（pH 7.0）酶活力的突变体为阳性突变体[图7-11（2）]。

图7-11 β-1，3-1，4-葡聚糖酶的定向进化

将定向进化和DNA改组得到的突变体文库进行人工筛选，采用LB培养皿（1）进行刚果红染色后得到比野生型β-1，3-1，4-葡聚糖酶（PtLic16A）能产生更大透明圈的突变体，经过纯化后得到突变体酶（PtLic16AM2）酶活力的最适pH分析（2）。

WT—野生型 Mutant—突变型

经过一轮易错PCR和DNA改组得到的突变体文库，经过两轮筛选，李一男等（2011）成功将β-1，3-1，4-葡聚糖酶（PtLic16A）最适酶活力pH从7.0变为5.0，在保持其热稳定性的同时，使其最大反应速率提高了40.7%。在pH 5.0下，分别测试野生型PtLic16A和突变体酶PtLic16AM2在65℃、70℃、75℃的半衰期，发现70℃时PtLic16AM2的半衰期是236.1min，而PtLic16A的半衰期是204.8min；75℃时，PtLic16AM2和PtLic16A的半衰期分别是23.9min和18.2min。这说明在酸性条件下，PtLic16AM2的热稳定性优于PtLic16A。

对突变体的测序发现，其中的三个氨基酸在易错PCR和DNA改组中得到了突变，分别是D56G、D221G和C263S。利用定点突变分别突变出只含有D56G、D221G和C263S的单突变PtLic16A，并对其酶活力进行研究，发现这三种单突变的比酶活力非常接近野生型（10128U/mg、11429U/mg、10482U/mg和11824U/mg）。其中单突变子C263S的最适pH为5.5，D56G的最适pH为6.0，而D221G的最适pH为7.0。推测突变酶PtLic16AM2最适pH相对于野生型向酸性偏移可能是由于C263S和D56G两个点突变共同作用的结果。对突变体酶PtLic16AM2的三维结构预测采用SWISS-MODEL server同源建模分析发现，突变酶中三个氨基酸残基的替换均位于酶结构的表面，远离其核心区的β-折叠层，而这些β-折叠层对于维持酶的稳定性至关重要。

在酶的定向进化中，将生物信息学、统计学以及计算机技术相结合进行合理化设计，可以作为定向进化的辅助方法，可以有效降低定向进化过程中的操作强度和提高酶在定向进化中的成功几率。Amold等用计算机的方法，限制了突变库的大小，减小了筛选正突变体的工作量。利用统计学的方法并结合构建的突变模型，对有限突变文库中发生的有益突变的位点分析发现，突变文库中的有益突变常常集中发生在那些对替换容忍程度大的氨基酸残基上。