易错PCR有时也被称为容错PCR，是非重组型构建突变文库的方法，是指在扩增目标基因的同时引入碱基错配，导致目标基因随机突变的一种DNA体外进化技术。易错PCR是通过控制适当的反应条件，改变二价离子的浓度和pH，使Taq DNA聚合酶在基因扩增的过程中，以可控制的比率使碱基发生错误掺入。通常实现“易错”的方法：①利用Taq DNA聚合酶不具有3′→5′校正功能的特点，以该酶为PCR中的DNA聚合酶随机引入突变。并通过调整PCR条件，将Taq DNA聚合酶的出错率从自然状态下的0.001%提高至约2%；②增加Mg²⁺浓度来稳定非互补的碱基对，提高一般DNA聚合酶催化下的PCR出错率；③通过添加Mn²⁺来降低聚合酶的特异性，从而提高PCR出错率；④引入4种不平衡浓度的核苷酸底物来提高非互补碱基配对的几率等。即便如此，经过一次突变的基因产物往往很难获得满意的结果。一般而言，较高的错误掺入率将同时产生中性突变和有害突变，存在于许多突变体当中的有益突变可以用重组PCR的方法将它们组合，通过重组可去除中性突变和有害突变。该方法是由Leung等1985年首次设计并报道，1992年由Cladwell和Joyce对其进行完善的。连续易错PCR（sequential error-prone PCR），即将一次PCR扩增所得到的突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机突变，使小突变累积而增大，提高重要有益突变的几率。Chen等用此策略使在非水相[二甲基甲酰胺（DMF）]溶液中定向进化枯草芽孢杆菌蛋白酶E的活性获得成功，所得突变体PC3在60%和85%的DMF中，催化效率k_cat/K_m分别是野生酶的256倍和131倍，比活性提高了157倍。而将PC3再进行两个循环的定向进化，产生的突变体13M在60%DMF中的k_cat/K_m比PC3高3倍，比野生酶高471倍。在易错PCR中，遗传信息的变化出现在单一分子内，故属于无性进化（asexual evolution）。该方法只能使原始酶中很小的序列空间发生突变，易出现同型碱基转换，因此一般适用于较小（＜800bp）的基因片段。但对于初涉及定向进化的研究者，易错PCR不失为一种有效实用的进化方法。

编者课题组对来自樟绒枝霉的角质酶进行定向进化，通过在易错PCR中提高Mn²⁺浓度来提高突变率，发现氨基酸突变率和Mn²⁺浓度呈现正相关，随着Mn²⁺浓度增加，扩增出的目标条带变暗。但并不是Mn²⁺浓度越高越好，在为0.3mmol/L的时候，突变率和库容量都符合要求（表7-3）。

表7-3 PCR中Mn²⁺浓度与突变率的关系(www.daowen.com)

β-1，3-1，4-葡聚糖酶在啤酒酿造和饲料工业中具有重要的应用价值。在啤酒工业中，β-1，3-1，4-葡聚糖酶水解麦芽汁中的β-葡聚糖，降低麦芽汁黏度，提高麦芽汁过滤速率，保持成品酒的稳定性。啤酒酿造的糖化工艺一般为65℃，体系中麦芽汁的pH一般为5.0～5.6，这就要求所用的β-1，3-1，4-葡聚糖酶在酸性条件下具有较强的催化能力。贾会勇等（2012）对嗜热拟青霉来源的β-1，3-1，4-葡聚糖酶（PtLic16A）进行以易错PCR为主要技术手段的定向进化，使其能够适应啤酒酿造中麦芽汁的酸性环境，从而降低麦芽汁中β-葡聚糖的黏度，提高麦芽汁的过滤速率。PtLic16A最适温度为70℃，耐热性好，能够经受啤酒酿造工艺中的温度，但该酶的最适pH为7.0。利用易错PCR定向进化该酶具体过程如下：用一对引物PtLic16A-F和PtLic16A-R扩增PtLic16A的编码序列，其中引物的5′末端分别引入BspHⅠ和XhoⅠ酶切位点，用于克隆到表达载体pET-26b。同时利用这对引物和Pfu DNA聚合酶通过常规的PCR程序扩增β-1，3-1，4-葡聚糖酶成熟蛋白质的编码序列，平行构建到pET-26b载体，用于定向进化实验的对照基因，也就是野生型PtLic16A的表达。需要引入随机突变的易错PCR体系中含有的扩增成分包括：7.0mmol/L Mg²⁺、0.2mmol/L Mn²⁺、0.2mmol/L dATP、0.2mmol/L dGTP、1mmol/L dCTP、1mmol/L dTTP、0.2μmol/L两种引物、2.5U Taq DNA聚合酶和20ng PtLic16A质粒。可以看出，此反应条件中有利于随机突变发生的因素有：①使用了高浓度的Mg²⁺。一般的PCR反应使用1.5～2.0mmol/L，在本反应体系中使用高浓度的Mg²⁺是为了稳定非特异性的碱基对形成。②使用了Mn²⁺。在一般的高保真PCR反应中，完全不使用Mn²⁺，而在这里使用Mn²⁺是为了降低DNA聚合酶对模板的特异性。③使用了不平衡匹配的脱氧核苷酸浓度。例如与0.2mmol/L dATP相对应的dTTP使用了1mmol/L。④使用了无校对活性、易产生错配碱基的Taq DNA聚合酶。对于产生的随机突变DNA库，还进行了DNA改组，原理如下所述。