编码酶的基因在一定时间尺度内,在有机体内自发的存在随机突变、重组,从而使基因表达产物,即酶的生物活性符合有机体的生命功能需求的现象称为分子进化(molecular evolution)。酶的体外定向进化(directed evolution in vitro)本质上是在实验室条件下,即在试管中,在可控的时间尺度内(几个月或者几周内)模拟自然进化机制,对编码酶的基因进行随机诱变、重组,再通过高通量筛选或者其他选择方法定向选择出性能更加优良的酶或创造出新酶的试验手段。酶的定向进化方法实用性较强,可以改造整个生物合成和生物降解途径。例如,1993年Chen等通过易错PCR技术进行定向进化,使得枯草芽孢杆菌蛋白酶在非水相中催化活性提高157倍;2000年Zhang等用易错PCR技术进行定向进化,使天冬氨酸酶的Km降低至野生型的46%,酶活力提高28倍。利用定向进化方法可以改变生物催化剂的性能,还可以赋予生物催化剂原本不具备的催化活力和性能,该方法是一种生物体外(试管中)模拟达尔文进化的快速、有目的地改造蛋白质的方法。相对于在已知蛋白质结构的情况下进行有目的地改造蛋白质的“理性设计”(rational design)方法,这种方法称为“非理性设计”(irrational design)。
定向进化方法始于随机DNA片段文库的建立与基因多样性文库的产生,然后通过高通量的筛选,鉴别酶的基因,并将上述基因再通过诱变、筛选、积累有益的突变。通过基因定向进化大大加快了不同品种或不同基因之间的重组进化速度,在产生的突变库中,由于个体差异以及亲本的差异更大,因此可以更快地获得所需突变体。酶的定向进化流程包括:①通过随机突变、基因重组创造基因多样性并建立突变文库;②将突变文库中的基因在适当生物体内表达;③对基因产物进行分析,通过高通量筛选(high throughput screening),检出预期性状改善的阳性结果;④对阳性结果进一步进化;⑤重复上述循环,直到获得预期性状的新型酶。目前,酶的定向进化主要在以下几个方面开展工作:在非自然条件和极端环境中(此时酶的活性和稳定性低)酶稳定性和功能的提高;对新底物催化活性的提高、特异性的调节(尤其是对映体选择性)以及在异种宿主中异源表达的提高。(www.daowen.com)
突变文库中突变体的量、突变文库建立的简便性和建立方法的可操作性在很大程度上影响着进化的效率。根据创建突变文库方法的不同可以大致分为非重组型和重组型定向进化。如今已发展的定向进化常见的有易错PCR(error-prone PCR)、DNA改组(DNA shuffling)、交错延伸(stagger extension process)和体外随机定位突变(random site directed mutagenesis in vitro)等技术。
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