酶的化学修饰，就是在分子水平上对酶进行改造，通过引入与去除化学基团，使蛋白质的共价结构发生改变，以达到改变结构与性质的目的，即用人工方法和一些具有生物相容性的试剂改变酶的结构与性质，创造天然酶所不具备的某些优良特性以及新的活性，从而扩大酶的应用范围。从广义上说，凡涉及共价结构或者部分共价键的形成或者破坏的转变都可以视为酶的化学修饰；从狭义上说，酶的化学修饰则指在较温和的条件下，以可控制的方式使一种酶同某些化学试剂发生特异反应，从而引起单个氨基酸残基或者其功能基团发生共价的化学变化。

在生物体内存在着酶分子的天然化学修饰过程，如酶原激活、磷酸化、糖基化、可逆共价调节等。分子修饰的传统方法是采用物理、化学方法和酶法对目标酶中的特定氨基酸残基进行修饰改造。随着固定化技术和基因工程技术的发展，已能采用定位突变和定向进化技术对酶分子进行改造。酶的化学修饰主要包括以下几方面：①对酶分子催化位点的氨基酸侧链基团化学修饰，提高其催化效率；②对酶分子表面氨基酸侧链的修饰，改造酶的性能，增加酶的稳定性；③对酶分子内或分子间的交联，或与水不溶性载体的结合制成固定化酶，提高反应后酶的回收重复利用性。

酶分子表面各氨基酸残基因自身极性和电荷的不同而相互作用，另外酶分子在表面区域与水相互作用，形成了一层不易解离的水合层（hydration shell），酶活性部位和其他骨架部位都是处于这种紧密影响着氨基酸残基电离状态的微环境中，进而影响酶的活性和稳定性。经过化学修饰后，不仅能减少由于内部结构被破坏而引起的酶分子延展打开，亲水性大分子修饰剂还能在酶分子表面形成一层稳定的“人工水合层”，在一定程度上抵御外界pH和溶剂的变化，维持酶活性部位和整体骨架微环境的相对稳定。通过酶化学修饰可以改变天然酶的一些性质，使酶生物活性提高、改变催化特异性、增强在恶劣环境中的稳定性、降低排异反应、扩大酶的适用范围并且在理论上为生物大分子构效关系的研究提供实验依据，是改善酶学性质与提高其应用价值的一种有效措施。近年来，酶分子的化学修饰研究在修饰方法、修饰试剂等方面都有很大的进展。

在酶化学修饰时，应注意以下几点：①酶经pH处理后，或经氧化、还原修饰后，要进行总的氨基酸分析，特别要分析那些难修饰的氨基酸（如色氨酸、甲硫氨酸）如何变化；②因为修饰剂对一种酶的选择性不一定适用于另外一些酶，所以，应该搞清楚所用的酶是否被真正的修饰；③控制修饰反应的条件，如注意缓冲溶液成分或修饰副产物对修饰部位的修饰程度及对酶活力的影响；④天然酶活力的最适pH与修饰后酶活力的最适pH可能有显著差别；⑤天然酶与修饰酶对金属离子的需要在程度上和性质上也有所不同。

酶化学修饰的方法有大分子结合修饰、小分子结合修饰、有限水解修饰、分子交联修饰、侧链基团修饰、引入辅助因子、固定化修饰、亲核标记修饰等，简要介绍如下。

1.大分子结合修饰

作为酶化学修饰中最重要的方法之一，经化学修饰后的酶可以明显增强酶活力，如1分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖苷结合，酶活力比原来提高5.1倍。常用的一些大分子修饰剂如右旋糖苷（dextran）、聚乙二醇（PEG，polyethylene glycol）、聚蔗糖β-环糊精、琼脂糖、壳聚糖、聚丙氨酸、清蛋白、明胶、淀粉、硬脂酸、酰氯等与酶的氨基酸残基侧链共价结合，使酶成为具有特定功能的单位或聚合体。其中，两性亲和分子聚乙二醇及其衍生物是最常用的化学修饰剂，不仅能提高酶在有机溶剂中的稳定性和溶解性，也能降低一些治疗用多肽类药物的抗原性。如用聚乙二醇及其衍生物修饰精氨酸酶、超氧化物歧化酶（SOD）以及L-天冬酰胺酶后，可使其抗原性显著降低；对白血病有显著疗效的L-天冬酰胺酶经右旋糖酐或者聚乙二醇结合修饰后，都可以使其抗原性显著降低甚至消除。酶的PEG修饰包括两个部分：①PEG的活化；②活化后PEG与酶的共价结合。目前已有一些酶采用PEG法进行修饰，如细胞色素C、内-β-葡萄糖酶、胰蛋白酶等。应用于酶表面修饰的PEG多为单甲氧基聚乙二醇（mPEG），分子质量一般在500～20000Da，在降低修饰抗原性方面，大分子mPEG的修饰剂优于小分子，分子质量越大效果越好，其中以mPEG-5000（n=150）修饰效果最好；在保持酶活性方面，小分子活化的mPEG优于大分子。人们也使用活化的单甲氧基聚乙二醇代替PEG进行对酶制剂的修饰。例如，在对L-天冬酰胺酶的修饰过程中，用底物L-天冬酰胺来保护酶的活性中心，得到的修饰酶抗体结合能力消失，保留了酶比活力32.8%，酶的常温稳定性和热稳定性均有显著提高，用荧光胺法分析残余的氨基数目发现酶分子中的92个自由氨基中有51个与修饰剂结合。最近一种新型的非离子型两亲化合物聚氧乙烯十二烷基醚（Brij35）得到了广泛的研究，研究表明其修饰酶的效果比PEG的效果更好。过氧化氢酶在三氯乙烷中，其酶活力是天然酶活力的200倍，而在水溶液中，其酶活力是天然酶活力的15～20倍，当过氧化氢酶在水溶液中被Brij35修饰后其酶活力比在水溶液中经PEG修饰的过氧化氢酶要高。早在1984年，Takahashi等发现活化的PEG修饰的过氧化氢酶可以溶解于苯液体中并保持很高的活性，之后同样的现象发生也在过氧化物酶、脂肪酶、胰凝乳蛋白酶等一系列酶上。超氧化物歧化酶（SOD）在体内的半衰期仅为6～30min，用PEG修饰后半衰期延长70～350倍，可以提高到35h左右。大分子物质可以在酶分子的外围形成保护层，使酶的空间结构得以保护，从而使酶的稳定性大大增强。

2.小分子结合修饰

酶表面一半的基团属于极性氨基酸，利用小分子化合物对酶的活性部位或者活性部位之外的侧链基团进行化学修饰，从而对酶进行改造，以改变酶的性质，改善酶的分散性，提高酶的表面活性，使酶的表面产生新的物理、化学、机械性能及新功能，改善酶与其他物质的相容性，称为酶的小分子结合修饰。在酶的表面有许多游离的羟基、酚羟基、巯基、氨基等官能团，可以与一些小分子物质如醛、铜、羧酸等发生烷基化、酰化、醚化等反应。目前广泛应用的小分子修饰剂主要有氨基葡萄糖、乙酸酐、邻苯二酸苷等。如环糊精转糖基酶能催化环化、偶合、歧化和淀粉水解反应。环糊精转糖基酶经丁二酸酐修饰后，其环化、偶合、水解的活性降低，而歧化活性却提高了30%。Khajeh等利用柠康酸酐对土壤细菌水解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌两种细菌体内淀粉酶的赖氨酸侧链进行修饰，带负电的羧基基团取代了带正电的赖氨酸伯氨基基团，其中水解淀粉芽孢杆菌淀粉酶（BAA）上有13个赖氨酸侧链、地衣芽孢杆菌淀粉酶（BLA）上有10个赖氨酸侧链被取代。在70℃或80℃时，修饰后的BAA的活力比自然状态下无修饰的酶高。在较高温度下，BAA的天冬酰胺酸残基发生脱酰胺反应，而修饰后的酶较少发生这种反应。可能是BAA中的甲硫氨酸—组氨酸阻碍和延迟了脱酰胺反应。修饰后的BLA的稳定性虽然没有获得提高，但是在37℃下，修饰酶的k_cat/K_m增加了30%，而对BAA的修饰使修饰酶的k_cat/K_m减少了28%。

3.有限水解修饰

酶分子的结构中包含行使功能的必需基团和非必需基团，必需基团中活性中心外部分与非必需基团构成了酶的非活性中心。活性中心外的必需基团维持活性中心应有的空间构象，活性中心内的必需基团分为催化基团和结合基团，其中催化基团影响底物中某些化学键的稳定，催化底物发生化学反应并将其转化为产物；结合基团与底物相结合，使底物与酶的一定构象结合在一起形成复合物。

在酶的肽链中特定位置进行水解，使酶的空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法，称为酶的有限水解修饰。这种修饰通常使用某些专一性较高的蛋白酶或肽酶作为修饰剂。常见的修饰酶有木瓜蛋白酶、真菌蛋白酶、胰酶、胃蛋白酶等。酶蛋白的肽链水解后，可能引起不同的结果：①若碳骨架的断裂引起酶活性中心破坏，酶将丧失其催化功能，这种修饰主要用于确定酶活性中心的位置及其关键氨基酸残基。②若碳骨架断裂后，仍可以维持酶活性中心空间构象，则酶的催化功能可以保持不变或损失不多，但是其抗原性显著降低，这将提高某些酶的使用价值。例如，用亮氨酸氨肽酶去水解由180个氨基酸连接而成的木瓜蛋白酶，可以除去其肽链的三分之二，也就是除去多肽链上的120个氨基酸，酵母的烯醇化酶经肽链有限水解后，除去由150个氨基酸残基组成的肽段后，这两个酶的活力基本保持不变，而它们的抗原性却大大降低，而且在以后的生产中造成的代谢负担变小。③若碳骨架的断裂有利于酶活性中心的形成，或者使原来的活性中心更加暴露在溶剂中而有利于底物的结合，则可使酶分子显示其催化功能或使酶活力提高。一般来说酶原的激活属于这种情况。

除了蛋白酶对酶进行有限水解外，也可以用一些化学方法进行修饰。例如，枯草杆菌中性蛋白酶，先用EDTA等金属螯合剂处理，再用纯水或者稀盐溶液进行透析，可使其部分水解成仍具有酶活力的小分子肽段，却不产生抗原性，具有良好的消炎疗效。但是运用化学方法进行水解修饰，由于反应条件较剧烈，往往会造成酶的功能特性和生物活性降低或者丧失。

4.分子交联修饰(www.daowen.com)

酶的分子交联修饰是指用某些双功能基团试剂，如戊二醛、己二胺、葡聚糖二乙醛等，使酶分子内或分子间肽链的两个游离氨基酸侧链之间形成共价交联，使酶分子的空间构象更加稳定，从而提高酶分子的稳定性，并提高酶在非水溶液中的应用价值。Richards最先使用戊二醛进行酶交联的研究，如图7-9所示，戊二醛既可以交联不同酶分子间的赖氨酸残基，也可以在同一个酶分子内的不同赖氨酸残基内进行交联。Clair和Navia首次证实了利用交联酶晶体（crosslinked enzyme crystal，CLEC）技术提高了嗜热菌蛋白酶的生物活性，增加了其热稳定性。枯草芽孢杆菌蛋白酶经预处理，冻干形成交联酶晶体，在有机溶剂和水溶液中的稳定性大大增加，活力可提高13倍。交联酶晶体的制备分为两步：①酶晶体的形成；②在保持酶活性不降低，酶晶体的晶格不被破坏的同时，进行化学交联。

图7-9 戊二醛的酶交联作用

注：戊二醛能和赖氨酸上的伯氨基发生共价链接，在酶分子内（点划线）和分子间（虚线）进行交联。

（1）分子内交联通过增加酶分子表面交联键的数目来实现，是提高酶稳定性的方法之一。例如，胰凝乳蛋白酶的羧基经碳二亚胺活化后，可与一系列的二胺发生相互作用，使酶的稳定性显著增强。糖基化作用与交联技术联合应用于青霉素G酰化酶：采用葡聚糖二乙醛对青霉素G酰化酶进行分子内交联，可以使其在55℃下的半衰期提高9倍，而最大反应速度不变，酶的稳定性提高的主要原因是交联增强了葡聚糖的羟基与酶分子亲水基团间的相互作用。

（2）分子间交联用双功能试剂将不同的酶连接起来，酶分子间的共价交联可以产生杂合酶，例如用戊二醛将胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交联在一起。该杂合酶的优点是降低了胰蛋白酶的自溶作用，减少了反应器的体积。将大小、电荷和生理功能各异的两种药用酶交联在一起，便可在体内将多种酶同时运输到同一部位，达到提高药效的目的。

5.侧链基团修饰

酶分子的侧链基团修饰，可用于研究酶分子的结构与功能。采用荧光剂作为修饰剂，可通过荧光光谱分析了解溶液状态下酶分子的构象；可研究各种基团在酶分子中的作用及对酶的结构、特性和功能的影响；还可测定某一基团在酶分子中的数量。酶分子表面有许多游离的官能团，如氨基（—NH₃）、羧基（—COOH）、羟基（—OH）、酚羟基（—PhOH）、巯基（—SH）、咪唑基等，可与一些化合物发生烷基化、酰化、醚化等反应。经与小分子反应修饰后，酶的催化活性或稳定性得到了不同程度地提高，抗原性降低，还可能引起酶的催化特性和功能的改变。因此，酶的侧链基因修饰也是改善酶学性质并提高其使用价值的非常有效的措施。α-胰凝乳蛋白酶表面亲水性较强的—NH₂、—COOH被一定程度修饰时，在60℃时酶活力提高1000倍，随着温度的提高，稳定化效应更加剧烈，这种酶可以在极端的条件下不失活，具有很高的应用价值。经这种方法修饰后的水溶性稳定的酶制剂，特别是蛋白酶和脂肪酶，在食品行业和洗涤行业中显示出巨大的潜力。

根据化学修饰剂与酶分子之间反应的性质不同，主要修饰反应有酰化反应、烷基化反应、氧化和还原反应、芳香环取代反应等类型。脱氨基作用可改善酶的稳定性，消除酶分子表面氨基酸的电荷；酰化反应可改变侧链羟基性质。这些修饰反应可稳定酶分子有利的催化活性现象，提高抗变性的能力。

6.引入辅助因子

在低温中性的介质中，酶具有很高的底物专一性和催化活性，许多酶都含有很多辅酶或辅基等活性基团，天然酶中这些活性基团的种类是有限的，因而导致了酶催化底物的种类范围很窄（表7-1），从而限制了酶的一些功能。为了拓宽酶催化的底物，经常使用的方法是在这些辅助因子上引入一些其他的功能基团，再将修饰后的辅助因子取代天然酶中原有的辅助因子，便可得到多种多样具有新型功能的酶。用Cu（Phen）²⁺配合物与脂肪细胞类脂键合蛋白（ALBP）共价结合，生成半合成金属酶ALBP-Phen-Cu（Ⅱ）。在温和的条件下，该修饰酶可以选择性地水解多肽，也可以在恶劣的条件下促进芳香族酰胺化合物的水解。Sinha等采用固相合成技术用一种人工合成的以磷酸吡哆胺为辅助因子的氨基酸对核糖核酸酶S的C-肽上残基Phe8进行取代，这种辅因子的导入使得该酶的反应速度提高了20%。

7.亲和标记修饰

亲和标记是一种特殊的化学修饰方法。早期人们利用底物或者过渡态类似物作为竞争性抑制剂来探索酶的活性部位。如果某一试剂使酶失活，那么可以推断能与该试剂反应的氨基酸是酶活力所必需的。利用此技术研究酶的活性部位已经取得了很多有价值的结果。但一般的化学修饰技术最突出的局限性是专一性不高，它们与酶分子反应时，不仅能作用于活性部位的必需基团，而且能作用于活性部位以外的同类基团，这种局限性虽然可以通过底物保护的方法进行差示标记（differential labeling），但操作比较繁杂。因此，为了提高修饰反应的专一性，将上述两种方法结合起来，在底物类似物上结合化学反应基团，使它们与酶有较高的亲和力而进入酶的活性部位，因而抑制剂在活性部位的浓度远远高于活性部位以外的区域，从而与酶共价结合，使酶失活。这类试剂称为导向活性部位的抑制剂，又称亲和标记试剂。例如，胰凝乳蛋白酶的共价抑制剂对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）就是这类抑制剂。

酶化学修饰的局限性在于，大多只能在含有极性的氨基酸残基侧链上进行，但酶中含有很多不含特殊功能基团的氨基酸，而且从X射线晶体衍射结构的分析结果表明其余的氨基酸残基在维持酶的特定空间构象方面也起着很重要的作用，并在种属差异比较的角度来看，它们在进化上又比较保守。结构学研究结果分析表明，这些氨基酸侧链在维持蛋白质的特定空间构型方面起重要作用，酶化学修饰的结果在对研究酶的结构与功能的关系上能提供一些信息，如哪些氨基酸残基是必需的，哪些氨基酸残基是不需要的，但是用化学修饰法研究仍缺乏一定的准确性和系统性。因此，化学修饰方法不能用来研究这些氨基酸残基在蛋白质的结构与功能中的关系。目前很少有对某一氨基酸侧链绝对专一的化学修饰剂，而且同一种氨基酸残基在不同酶分子中存在的状态也不尽相同，因此同一修饰剂对不同蛋白质的修饰行为不同，难以预测。