杂合酶（hybrid enzyme）由两种以上的酶成分构成，把来自不同酶分子的结构单元（功能基团、二级结构原件、三级结构或结构域）进行组合或者交换，以产生具有所需性质的优化酶杂合体。

杂合酶的主要研究需求包括：现有酶应用于工业条件下存在稳定性和催化活性不足、底物专一性需要提高或者降低、改变酶的最适反应条件（pH、温度）的问题。大多数杂合酶是通过蛋白质工程法构建的。杂合酶的构建方法是DNA水平的基因操作和酶学检测方法的结合，其实质是突变和筛选，把来自不同分子的酶的（亚）结构域进行重组成为一个新的单一结构域，或者把来自不同酶的本身没有活性的单元重组起来，同时在一个体系中筛选，就可能获得比亲本功能更高效率的、衍生出新功能的子代重组体。产生杂合酶的方法大体上分为两类：一类是非理性设计法，主要通过构建各种库，再从库中筛选出所需要的杂合体；另一类是理性设计法，要求对操作对象的结构和功能有清楚的了解，实现结构元件从一个蛋白质转移到另一个蛋白质，产生杂合酶。杂合酶的构建策略包括点突变及二级结构互换、功能域的替换和融合蛋白三种常见的方式。

（1）点突变及二级结构的互换 通常杂合酶中相关酶的同源序列互换会导致酶活力的降低，因为同源序列的相似性越低，会使形成正确构象的概率越低，杂合酶的活力也随之降低甚至完全失去活性。通过随机的点突变则可以在一定概率上保持酶的活力，原因是它引进的新的折叠方式可能使酶恢复了原来的活力。通过点突变及二级结构的互换构建杂合酶如图7-6所示。RTEM-1β-内酰胺酶和来自普通变形杆菌（Proteus vulgaris）的β-内酰胺酶有37%的相似性，但两者在18种杂合酶中大部分是无活力的，仅有几种杂合酶具有部分或者很低的活力。接下来对于具有部分或者很低活力的杂合酶进行随机突变，则可明显地提高这些杂合酶的活力。蛋白酶有一个共同的靶点，往往是底物的结合位点，可用来互换底物的专一性，如胰蛋白酶通过在活性部位互换4个氨基酸残基转变为胰凝乳蛋白酶等。Marlowe等将胶原纤维中的甘氨酸分别突变为丙氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸和丝氨酸，得到的4个突变体的分子结构和胶原纤维强度与原酶相差很大，证明了改变单一氨基酸可以很大程度上改变酶的性质。

图7-6 通过点突变二级结构互换的方式构建杂合酶示意图

（2）功能域的替换 如果把一个酶的功能结构域看作是构建酶的组件，则可以通过互换这个功能域组件来构建催化特定反应的酶，功能域替换杂合酶的示意图如图7-7所示。

图7-7 通过功能域替换制备杂合酶示意图(www.daowen.com)

功能域的交换有分子内交换和分子间交换。功能域的转移可采取三种不同的类型：第一，将一种蛋白的功能基团转移至同系结构蛋白上。如S1家族的丝氨酸蛋白酶由两个同源β-桶亚结构域组成，其界面形成活性部位裂隙。该酶的疏水结构域和催化三联体（Ser-Asp-His）是保守的，但围绕活性部位的表面环是可变的，并且负责酶的底物专一性和活性调节等性质，因此，S1家族的丝氨酸蛋白水解酶是通过亚结构域交换而产生新酶的良好候选者。第二，转移功能序列到呈现出刚性骨架的蛋白质上。将功能肽序列以插入序列形式转移至球蛋白的容许区域内以限制构象柔性，就可以把这个序列呈现在受控制的结构中。第三，转移活性部位到一个新的结构上。将结构清楚的活性部位转移到结构不相关的蛋白质上，仍然可以保留转移部位的结构与功能。例如，θ-型谷胱甘肽转硫酶（GST）具有谷胱甘肽的结合部位，其Ser11与谷胱甘肽的巯基形成氢键来稳定谷胱甘肽的巯基形式。如果将谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）的催化基团——硒代半胱氨酸转移到θ-型谷胱甘肽转硫酶（GST）的第11个丝氨酸就可以将GST转化为GPX。突变酶的GPX活力超过了某些天然GPX的活力，其底物专一性、催化动力学及反应机制都发生了改变。转移活性部位至天然骨架蛋白质上，可产生有效的功能蛋白质，其优点在于：可以利用新的结构骨架诱导特定序列的特定构象或者稳定预定活性部位的构象；可以构建一组特定的可以代表二级结构或三级结构模块的结构域，然后将活性序列转移至这些模块上以产生新的功能；有助于理解底物—酶、辅酶—酶、DNA-蛋白质、蛋白质—蛋白质之间的相互作用。

（3）融合蛋白 融合蛋白（fusion protein）是将编码两个功能蛋白质的基因末端融合，从而产生融合蛋白，这一手段对于蛋白质的表达纯化和吞噬体表面蛋白质展示、细胞内富集、代谢工程和蛋白质折叠的研究是非常有利的。融合蛋白的常用方法包括：设计具有专一性标签的双功能或多功能蛋白质、构建天然酶和人工酶系统、在人工组合结构域间创造别构作用。融合蛋白的构建示意图如图7-8所示。

图7-8 融合蛋白构建示意图

标签结构域可以理解为一种能够指定多肽和蛋白质在细胞中不同部位分布的结构域，机体通过标签结构域把蛋白质分配到特殊部位。由于它们通常是独立于核心蛋白质折叠的，所以很容易操控它们，蛋白质与特殊标签结构域的融合已经成为蛋白质工程的标准工具。

杂合酶技术是将DNA水平上的突变筛选和蛋白质水平上的酶学研究相结合的一门综合技术。它将传统的酶活性筛选法同方便的DNA重组技术有机地结合起来。这一技术的引入使得分子酶学的研究摒弃了烦琐的蛋白质序列研究和繁重的菌种选育这一传统做法，为加快构建新酶和改进生物工艺过程开创了一条新途径。