酶的三级结构是指酶的多肽链中二级结构元件（α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲等）在空间中通过次级键或者二硫键维系、固定所形成的具有一定生物活性功能的蛋白质三维结构，包括在一级结构中相距甚远的肽段之间的相互关系和侧链在三维空间中彼此间的相互关系。三级结构的形成使肽链中所有的氨基酸残基相对位置都达到了空间上的重新排布，在一级结构中相距较远的氨基酸残基，有可能在三级结构中变得比较接近并相互作用、与底物中相关基团相互识别、协同完成一类催化反应。

（一）酶的三级结构

第一种类型以典型的二级结构元件形成闭合的结构，如磷酸丙糖异构酶（triose phosphate isomerase）和丙酮酸激酶结构域1（pyruvate kinase domain 1）的单绕平行β-桶，是由8个平行β-折叠股环形排列形成的，在第1和第8两个折叠股之间借氢键键合形成闭合圆桶（cylinder）。它是一种具有高度对称性的结构，这种结构是由肽链按Rossman折叠方式单向卷绕而成，也即由βαβ单元通过交叉连接而成的[图7-3（1）和（2）]。

和上述环绕方式截然不同的是一些形成开放的非闭合三级结构，如乳酸脱氢酶结构域1（lactate dehydrogenase domain 1）和磷酸甘油酸激酶结构域2（phosphoglycerate kinase domain 2）中的α，β-结构，中间是由4～9个平行的折叠股或混合型的β-折叠股构成的开放β-折叠片[马鞍形扭曲片如图7-3（3）和（4）]，β-折叠片的两侧由α-螺旋和无规卷曲结构环绕。这种结构虽然也由β α β单元装配成，但单元的连接方式与平行β-桶不同，有的β α β单元是翻转180°后再与其他单元连接，这样就形成了开放式扭曲片，而α-螺旋分处于扭曲片的两侧。这种结构之所以称为双绕平行β-折叠片是因为它可以看成是肽链从β-折叠片的中间开始沿相反的两个方向向外卷绕，即肽链从折叠片中开始向一个方向卷绕形成Rossman折叠，此时α-螺旋覆盖在折叠片的另一侧。再如谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase）含有反平行β-折叠片，也称“露面夹心”结构[图7-3（5）和（6）]，它是由3～15个β-折叠股构成的单层反平行β-折叠片，虽然也是扭曲的，但不闭合成桶。在β-折叠片的一侧有一层α-螺旋和回环，折叠片的另一侧暴露于溶剂。

图7-3 酶的三级结构中的结构域

（1）和（2）磷酸丙糖异构酶中的闭合圆筒结构（3）和（4）乳酸脱氢酶中的马鞍形扭曲片（5）和（6）谷胱甘肽还原酶中的露面夹心结构

注：图中黄色表示β-折叠片，红色表示α-螺旋，绿色表示无规卷曲

（二）酶的三级结构的特征

（1）酶的三级结构一般包含多种二级结构元件，如溶菌酶同时含有α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲等多种二级结构元件，但不同酶中的多种元件的含量是不同的。

（2）酶的三级结构一般具有明显的折叠层次，多肽链主链在熵驱动下折叠成由氢键维系的α-螺旋、β-折叠等二级结构；在一级序列上相邻的二级结构往往在三维折叠中彼此靠近并相互作用形成超二级结构；由超二级结构进一步组装成相对独立的球状实体——结构域或三级结构，或再由两个或多个结构域装配成紧密的球状或椭球状的三级结构，如己糖激酶。

（3）酶的三级结构一般是紧密的球状或椭球状实体，如水溶性球蛋白酶；多肽链折叠过程中各种二级结构彼此紧密装配，但是它们之间也插入松散的片段，如无规卷曲和β-转角等结构元件。装配密度是指一个蛋白质的组成氨基酸的范德华体积（van der Waals volume）总和（组成的原子依范德华作用范围所占的总体积）除以蛋白质所占的总体积，一般为0.72～0.77。这意味着即使蛋白质装配得很紧密，仍有25%的体积不被蛋白质中的原子占据。越是临近活性部位的区域，密度比平均值越低，这意味着活性部位分布在较松散的区域，并且具有较大的空间可塑性，使其构象容易发生变化，可允许活性部位的结合基团和催化基团有较大的活动范围。这是酶与底物、别构酶与调节物、其他功能蛋白质与效应物的相互作用的结构基础。

（4）酶的疏水侧链一般埋藏于分子内部，亲水侧链暴露于分子表面。酶形成三级结构的驱动力，是使酶的肽链折叠成为最可能的稳定结构，从而使该结构的自由能最低。这里有两种力在起主要作用：一方面是肽链必须满足自身结构固有的限制，包括折叠中α-碳的二面角的限制以及手性效应；另一方面是熵驱动下的肽链折叠，以最大化地埋藏疏水侧链，使之与溶剂水的接触降到最小。从拓扑学的角度上看，一般酶都含有一个安置疏水核心的“内部”和一个被亲水基团所覆盖的“外部”。隐藏疏水基团避免与水接触是安排二级结构元件、形成三级结构的主要动力。疏水核心几乎全部由β-折叠片和α-螺旋组成。虽然肽主链是具有一定极性的，但是这两种二级结构元件能够很好地形成氢键网络，主链极性已被有效地中和，因而能稳定地处于疏水核心区域。在酶的三级结构中，多数α-螺旋都是两亲螺旋（amphipathic helix），它们的一面多是极性或者酸碱氨基酸残基向外暴露于溶剂，另一面多是疏水氨基酸残基朝向蛋白质的疏水内部。β-折叠一般存在于蛋白质的疏水核心，反平行β-折叠片疏水氨基酸残基比较多的一侧朝向分子内部，亲水氨基酸残基比较多的一侧与溶剂接触。总体而言，酶分子中有80%～90%疏水侧链被埋藏，而酶分子表面有亲水侧链，因此酶作用的环境都是在溶液状态下。

（5）酶分子表面一般都有一个口袋，它是通过与底物、效应物结合而行使生物活性的功能部位。口袋能容纳1～2个小分子配体或大分子配体的一部分，口袋周围分布着许多疏水侧链，为底物发生化学反应创造了一个低介电区域。(www.daowen.com)

酶的三级结构的测量方法，主要包括核磁共振波谱法、X射线晶体衍射法和冷冻电镜法。核磁共振波谱法利用不同化学环境下原子核吸收电磁波能量不同来分析酶分子中该原子所处的位置；X射线晶体衍射法依靠将酶蛋白质结晶后，利用X射线在晶体上的衍射反推出晶体中各原子的空间排布位置；冷冻电镜法则是将酶蛋白分子在碳膜上尽量铺列成单层，然后利用高能电子束透射过蛋白质分子，得到一个酶分子各个不同角度的投影，进而三维重建出这个酶蛋白分子的立体结构。编者课题组（2015）报道了一种米黑根毛霉菌来源β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶的晶体结构，该酶中出现了很明显的三级结构的排布和不同的结构域（图7-4）。

图7-4 酶的三级结构（糖苷水解酶家族3中米黑根毛霉菌β-N-乙酰氨基葡糖苷酶的三级结构）

注：红色、绿色、蓝色分别代表不同的结构域，整个结构是由一条肽链盘绕折叠而成

结构域是多肽链在二级结构或超二级结构的基础上形成的具有特异结构和独立功能的区域，形成空间上可以分辨的组织，是三级结构的一部分。最常见的结构域含序列上连续的100～200个氨基酸残基，少的有30～40个，多的则在300个以上。结构域有时也指功能域（functional domain），一般来说，功能域是蛋白质分子中能独立存在并行使一定功能的基本单位。功能域可以是一个结构域，也可以是由两个结构域或两个以上结构域组成，如酵母己糖激酶（hexokinase）的功能域（活性部位）就是由两个结构域构成，并处于它们之间的交界处。许多多结构域的酶，其活性中心都位于结构域之间，因为通过结构域容易构建具有特定三维排布的活性中心。结构域之间常常只有一段柔性的肽链连接，形成所谓铰链区，使结构域容易发生相对运动，这是结构域的一大特点。然而这种铰链不可能在亚基之间存在，因为它们之间只有非共价键的弱相互作用存在，没有共价连接。如果做相对位移较大的运动，亚基之间的弱相互作用被破坏后，亚基之间将完全分开。结构域之间的这种柔性（flexibility）将有利于活性中心结合底物和施加应力，并调整空间构象以利于催化的进行和产物的释放。活性中心以外的别构调节中心也会发生同样的柔性变化，有利于别构中心结合调节物和发生别构效应。

许多研究证明，酶的特殊催化能力只局限于在大分子的一定区域，也就是说只有少数氨基酸参与底物的结合与催化作用。这些特异的氨基酸残基分布的区域比较集中，构成了与酶活力直接相关的区域，被称为酶的活性部位或活性中心。通常酶的活性中心又包含两个区域：结合区域，决定了酶的催化专一性，负责与底物的结合；催化区域，决定了酶的催化能力，负责催化底物中旧键的断裂和新键的形成，或者底物构象的变化。

（三）酶的活性中心的特点

（1）活性中心只占酶分子体积的1%～2%。已知的绝大多数酶是由100多个氨基酸组成，分子质量在10kDa以上，直径大于2.5nm。而活性部位一般仅由2～3氨基酸残基组成，大小仅占酶的很小一部分。底物结合部位的残基数目因不同的酶而异，可能是一个也可能是多个。

（2）酶的活性中心的三维结构是在一定的外界条件下，由酶的一级结构决定的，是一个由底物结合氨基酸残基和催化氨基酸残基构成的三维实体。它是由在一级结构上相邻，或者相距很远，甚至位于不同肽链上的氨基酸残基，在空间结构上通过肽链的盘绕折叠而互相接近形成的。因此，在一级结构上看似互不相邻的氨基酸残基，有可能在三维结构中互相靠近，共同催化一个反应的进行。

（3）酶的活性部位结构形状往往并不是和底物的外形正好完美的互补，而是在酶与底物的结合过程中，底物分子与酶分子两者的构象同时发生变化，酶的活性部位与底物催化区域不断互相调整匹配，形成有利于底物键断裂与生成的构象。这个动态的过程也称诱导契合（induce-fit）。

（4）酶的活性中心位于酶分子表面的一个凹槽或者裂缝（cleft）内。底物分子或者其一部分与裂缝结合并在内部发生催化作用。裂缝是一个非极性氨基酸比较多的，具有相当疏水性质的区域。但裂缝内也含有某些极性的氨基酸残基，其非极性的性质在于产生一个微环境，或者极性氨基酸本身参与催化反应，在此环境中底物的局部有效浓度很高，便于酶与底物结合并有利于催化。

（5）酶的活性中心具有柔性，酶的支架部分具有刚性。邹承鲁对酶分子变性过程中的构象变化和活性变化进行了比较研究，发现在酶的变性过程中，当酶分子的整体构象还没有明显改变时，酶的活性中心已大部分被破坏，从而造成了酶活性的丧失。这说明相对于整个酶分子来说酶的活性部位更具有柔性，而除了活性中心以外的其他区域，则表现出一定的刚性。这一特征在理性设计酶的时候得到了充分应用，往往先找出合适的具有一定刚性的酶的大体结构支架，再把合适的催化中心移植进入这个支架，这部分内容将在本章后面部分进一步详细介绍。

研究酶活性部位的方法有酶分子侧链基团的化学修饰法、X射线晶体结构分析法、定点诱变法等。