均相酶促反应动力学是以研究酶促反应机制为目的发展起来的。作为酶工程技术人员，如果仅仅比较详细地解释了酶促反应机制和过程是不够的，还应对影响其反应速率的因素进行定量分析，建立可信赖的反应速率方程，并以此为基础进行反应器的合理设计和确定反应过程的最佳条件。因此，以讨论反应机制为目的的酶促反应动力学与为了设计及操作反应器的工业酶动力学，在研究方法上不尽相同。

（一）酶促反应的级数

在酶的催化反应过程中，酶自身是循环作用的而不会被消耗，[E]（酶浓度）是一个恒定值。因此，在其他条件不变的情况下，酶催化反应的速率只依赖于[S]（底物的浓度）。[E]恒定条件下，酶促反应速率与[S]的关系呈现一种双曲线关系（图6-8），反应速率v随[S]变化表现出三个不同性质的动力学区域。

图6-8 酶反应速率与底物浓度的关系

1—一级反应 2—混合级反应 3—零级反应

当反应底物浓度很低时，v随着[S]的增加而迅速增加，此时v与[S]的曲线呈直线关系，反应速率与底物浓度成正比，表现为一级反应（1区）。当底物浓度继续升高后，v随[S]的升高而继续加速，但是v增加的速度不如底物浓度较低时明显，即v与[S]的曲线不再呈直线关系，表现为混合级反应（2区）。当底物浓度继续增加到一定值后，再增加底物，反应速率不再增加，达到一个恒定的最高值，此时对底物来说是零级反应（3区）。

（二）中间产物学说与米氏方程

“中间产物学说”认为，催化反应的底物在转化为产物之前先与酶形成中间复合物，中间复合物再转化为产物，同时释放出游离酶。该学说由Brown和Henri首先提出来，后来Michaelis和Menten在此学说基础上设立了以下反应模式：

反应式中，E表示平衡时的游离酶；S表示反应底物；ES表示酶—底物复合物；k₊₁和k_-1分别表示正、逆方向反应速率常数；k₊₂为ES分解为产物时的速率常数。

反应速率v与底物浓度[S]之间的关系服从双曲线方程，如式6-3所示。

此方程即是米氏方程，式中v_max表示最大反应速率；K_m和v分别为米氏常数和反应速率。酶反应速率（v）是衡量酶活力大小的指标，用单位时间内（t）产物浓度[P]的增加或底物浓度的减少表示，即v=d[P]/dt或v=-d[P]/dt。[P]对t作图的[P]-t曲线（图6-3）即为酶促反应进程曲线，又称速率曲线。此曲线的斜率就是反应速率，表示单位时间内[P]的变化，曲线上某一点的斜率是该时刻的瞬时速率。酶动力学研究的是反应初速率，即时间趋向于零的速率极限值，时间越短越好。因为时间延长后速率会变小，随着[S]的下降，[P]会增加，逆反应速率会增大，同时也会出现产物抑制和酶蛋白变性失活。米氏方程的推导过程比较复杂，此处不做过多介绍。

（三）酶动力学参数及意义

1.K_m

K _m是酶的一个非常重要的特征常数，其物理意义是指复合物ES消失速率（k_-1+k₊₂）与形成速率（k₊₁）之比，其数值为酶促反应达到最大反应速率一半时的底物浓度，当v=v_max/2时，[S]=K_m。当反应系统中各种因素如pH、离子强度、缓冲液和反应温度等保持不变时，即对于特定的催化反应和反应条件，K_m是一个恒定的特征常数。因此，K_m也可用来判断或鉴别不同来源或相同来源但在不同条件下催化相同反应的酶是否是同一种酶。大多数K_m是在10^-5～10^-2mol/L范围内。

米氏常数K_m有如下含义：

（1）K_m是酶的一个特征性常数。即K_m的大小只与酶本身的性质有关，而与酶浓度无关。

（2）K_m代表反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。已知某个酶的K_m，就可计算出在某一底物浓度条件下，其反应速度相当于v_max的百分比。

（3）K_m可用于判断酶的专一性和最适底物。K_m可作为酶和底物结合紧密程度的一个度量指标，用来表示酶与底物结合的亲和力大小，K_m越大，酶与底物的亲和力越小，反之越大。因此，对于一个专一性较低的酶，作用于不同底物时，各底物与该酶的K_m存在差异，其中具有最小K_m的底物就是该酶的最适底物或天然底物。

（4）判断细胞内酶的活性是否受底物控制。如果测定的体外酶K_m远低于细胞内底物浓度，而反应速率没有明显的变化，则表明该酶在细胞内处于被底物所饱和的状态。反之，如果酶的K_m大于底物浓度，则反应速率对底物浓度的变化极为敏感。

（5）K_m还可帮助推断具体条件下某一代谢反应的方向和途径，只有K_m小的酶促反应才会在竞争中占优势。

2.v_max和k_cat

v _max和k_cat虽然不是酶的特征常数，但是当酶的浓度一定时，而且当[S]＞[E₀]的条件下，对酶的特定底物而言，v_max是一定的。同一种酶对不同类型底物的v_max也是不一样的。当[S]无限大时，v_max=k₊₂[E₀]，可以得出k₊₂=v_max/[E₀]。k₊₂为一级速率常数，表示单位时间内每个酶分子或每一个活性部位催化的反应次数，因此又称为酶的转换率（turnover rate）或转换数（turnover number）。在单一底物反应中，假设反应过程中只产生一个活性中间物时，k₊₂即为催化常数（Catalytic constant），用k_cat表示，其值越大，说明酶的催化效率越高。k_cat一般在5～100/min。

3.K_m和v_max的测定方法

酶促反应的米氏方程呈现典型的双曲线特征，用[S]对v作图不能准确地获得K_m和v_max，因此常将此方程转换成直线方程，由作图的直线斜率和截距求得K_m和v_max的值，常用的方法主要有以下几种。

（1）Lineweaver-Burk作图法 即双倒数法。该方法将米氏方程两侧各项做倒数处理，得到方程，如式（6-4）所示。(www.daowen.com)

作图得到图6-9，所得直线在纵坐标轴上的截距为1/v_max，在横坐标轴上的截距为-1/K_m，直线的斜率为K_m/v_max，因此，根据直线斜率和截距可计算出K_m和v_max。此作图法的两个坐标轴分别是[S]和v的倒数，故又称为双倒数作图法。双倒数做图法目前应用最为广泛，但是此方法也存在一些不足，如在[S]较低的一侧常因测定困难而导致v值误差较大。在[S]等差值实验时作图点在纵轴上较集中，因此在设计底物浓度时最好将1/[S]配置成等差数列，而非[S]，这样可使点距较为平均，再配以最小二乘回归就可以得到较为准确的结果。通常在测定动力学参数时都需要进行多次尝试，需要在前次测定结果的基础上合理调整底物的浓度，最后确保测定时所采用的底物浓度是在1/2～2倍K_m之间。

（2）Eadie-Hofstee方程 该方法是在双倒数方程的基础上，方程两边同时乘以v和v_max进行重排后得到新的方程，如式6-5所示。

图6-9 Lineweaver-Burk作图法求解K_m和v_max

根据方程作图如6-10所示，得到一条直线。直线的斜率为-K_m，纵坐标轴截距为v_max。该方法的优点是无误差放大，但是由于点分布不均不能够太精确。

图6-10 Eadie-Hofstee作图法求解K_m和v_max

（3）Hanes-Woolf作图法 该方法是在双倒数方程的基础上，方程两边同时乘以[S]进行重排整理后得到新的方程，如式（6-6）所示。

根据方程作图如6-11所示，得到一条直线。直线的斜率为1/v_max，纵坐标轴截距为K_m/v_max，直线延伸与横坐标轴相交的点为-K_m。该方法的优点是横坐标轴上的点分布均匀，缺点是1/v会放大误差。

（4）v_max对K_m作图法 在Eadie-Hofstee方程的基础上进行整理得到方程，如式（6-7）所示。

此方法以未知v_max和K_m分别为纵坐标轴和横坐标轴，将已知的底物浓度[S]标在横坐标轴负轴上，将测定的反应速率v标在纵坐标轴上，并将相应的[S]和v连成直线，各直线的交点坐标为（v_max、K_m）（图6-12）。此方法经常用于计算机模拟作图。

图6-11 Hanes-Woolf作图法求解K_m和v_max

图6-12 v_max对K_m作图

（四）双底物酶催化反应动力学

按照作用底物的数量，酶催化反应可以分为单底物催化反应和多底物催化反应，两个系统的动力学规律不完全相同。多底物催化反应是指两个或两个以上的底物参与反应，其动力学方程非常复杂，推导十分烦琐。

双底物酶催化反应是多底物酶促反应的主要组成部分，它是一类广泛存在的酶催化反应。其反应模式如下所示。

依据酶与底物结合及发生反应的程序不同可以分为两大类，即序列反应（sequential reaction）和乒乓反应（ping-pang reaction）。其中序列反应的含义是指酶结合底物和释放产物是按顺序先后进行的，它又可以分为顺序序列反应（ordered sequential reacion）和随机序列反应（random sequential reaction）。

1.顺序序列反应

两种底物A、B与酶的结合是按照特定的顺序进行，先后不能调换，产物P、Q的释放也有特定顺序，反应如下所示。

大部分脱氢酶如乳酸脱氢酶等都是遵循顺序序列反应完成催化反应的。

2.随机序列反应

顾名思义，此反应是与顺序序列反应相对的，即酶与底物结合的先后顺序是随机的，可以是先结合A再结合B，也可以是先结合B再结合A，没有固定的顺序，产物的释放顺序也是随机的。

如肌酸激酶的催化反应为：

该酶在催化反应的过程中，可以先和肌酸结合，也可以先和ATP结合，形成产物后可以先释放出ADP，也可以先释放出磷酸肌酸。

3.乒乓机制

这种反应是指各种底物不可能同时与酶形成多元复合体，酶结合底物A，释放出产物后才能结合另一种底物，再释放出另一种产物。由于底物和产物是交替地与酶结合或从酶释放，就如同打乒乓球一样一来一去，故称为乒乓反应。这种反应实际上是一种双取代反应，酶分两次与底物结合，然后分两次释放产物。