1.原理

如果控制一定条件，固定底物浓度，则酶反应速度与酶浓度成正比，且只受酶浓度因素影响，以此测得的酶反应速度可用来定义酶浓度。所以，酶活力的测定关键是控制测定反应的条件，排除其他因素的干扰。需要注意的是，酶活力测定通常是在该酶的最适反应条件下进行的，即最适温度、最适pH、最适缓冲液体系等，只有在最适条件下测定的结果才能真实地反映酶活力的大小。然而，在实际应用过程中，为了方便衡算和统一，酶活力的测定通常都是在当时的应用条件下进行的。

2.反应条件对酶活力测定的影响

酶活力的测定通常包括4个主要步骤，即底物溶液的配制、反应条件的确定、催化反应的进行和底物或产物的变化量的测定。确定反应条件的基本要求是要使反应系统中除了待测酶的浓度是影响反应速度的唯一因素外，其他因素都处于最适于酶分子发挥作用的水平。在建立一个测定酶活力的方法时，要考虑以下因素。

（1）底物 一般测定中用作底物的就是酶的最适底物（即工作底物）。例如，测定脂肪酶活力用橄榄油为底物，测定葡萄糖氧化酶活力以葡萄糖为底物，测定纤维素酶活力以纤维素为底物。有些酶具有绝对专一性，底物无可选择，如葡萄氧化酶、淀粉酶。有些酶表现相对专一性，则需要选择K_m较小者作为测定用底物。但一般还是选用工作底物来测定酶的活力，如胰凝乳蛋白酶可水解肽键、酰胺键和酯键，其最适底物是肽键，如用酯键作底物测定酶活力，对肽键并无多少意义。

一般还要求测定酶活力时，选用的底物在反应前后伴随物理化学性质变化，如脱氢酶用的NAD（P）⁺和NAD（P）H，或产气如CO₂，或[H⁺]变化等。如有时不能采用高底物浓度（如底物有毒性，价钱贵，溶解度小，抑制酶反应等），则可根据具体条件，通过实验选择一个恰当的底物浓度，这实际上也是一个测定浓度符合工作浓度的问题。有人建议遇上述情况采用[S]＜＜（远小于）K_m，成为一级反应。通常底物浓度[S]是K_m的十倍左右。(www.daowen.com)

（2）pH pH对酶反应可产生多种影响，所以进行酶活力测定要注意选择适宜的pH，并维持在这一范围内。一般选择在酶反应的最适pH条件下测定酶活力，要注意最适pH可能因温度与底物浓度的不同而不同。pH的稳定通常借助缓冲系统来控制。缓冲系统的离子、离子强度的选择十分重要，缓冲离子不同，即使同一酶反应所表现的活性水平也有差异。一般有这样一些规则：首先考虑所选择离子的pK与最适pH要接近，一般只差±1，因为在此条件下，缓冲能力最强。如在最适pH高于7.5的反应系统中，磷酸缓冲液就不适用，而要用Tris（三羟甲基氨基甲烷）缓冲液。其次，要注意所选缓冲液的离子对系统中其他离子有无化学反应，如柠檬酸、磷酸能与多价阳离子如Ca²⁺络合，硼酸能与多种有机化合物如呼吸中间体结合，从而抑制相应酶的活性。此外，要求缓冲离子对酶无抑制作用。Tris和磷酸缓冲液对大多数酶反应无抑制。所以，多采用Tris和磷酸缓冲液。也不能因稀释或温度改变而使pH发生大的变化，如磷酸缓冲液从0.5mol/L稀释为0.05mol/L会改变0.3个pH单位。温度改变引起pH的变化可在一般实验手册中查得。

如果有些缓冲液在可见光或紫外光区有光吸收，则不能用光吸收方法来测定酶反应。同样，有些缓冲液本身有电学性质变化，则酶反应不能用电学性质方法来测定。总之，采用的缓冲液不能干扰测定。在选择离子强度时除了应保证反应体系pH恒定外，也必须考虑到它可能对反应体系及酶本身带来的影响。一般如酶反应中无[H⁺]变化，则离子强度通常选0.02～0.05mol/L，否则如有[H⁺]变化，则选0.1～0.5mol/L。此外，要求缓冲系统价廉且易制备，不能被酶或反应系统破坏。

（3）温度 温度对酶反应速度的影响显而易见，酶反应的温度系数为每变化1℃，反应速度相差10%以上。所以，测定酶活力时温度保持恒定十分重要，一般应控制在 ±1℃以内。1961年国际生物化学联合会建议25℃为标准酶反应温度，1964年又建议改为30℃。但在实际工作中大家并没有遵守此规定，主要考虑如何控制一个准确范围。

（4）时间 反应时间对酶活力的测定值也有非常显著的影响，在酶反应的初始阶段，底物的浓度是大大过量的，因此酶的催化反应速率与酶的浓度成正比。随着反应时间的延长，酶的催化活力会受到产物的反馈抑制或者失去部分活力，酶的催化速率会缓慢下降。测定酶活力最好选择在酶反应的初始阶段，然而反应时间太短又容易导致误差较大，因此，一般将酶催化反应时间设定在5～10min。

（5）样品 样品中可能存在与待测酶作用同一底物或产物的其他酶，这就是所谓的干扰因素。在对样品中某酶的酶活力测定之前应确定干扰因素是否存在。其方法是：或同时采用不同测定方法，或同时检测酶底物和产物变化量，观察结果是否一致。如能确定干扰存在，就应根据具体情况采取措施消除干扰。消除干扰的主要方法：①选用适宜的测定方法；②加入干扰酶的抑制剂，或限制其所需的辅助因子；③对样品或试剂进行纯化；④制备相应空白对照。测定每个酶反应一般都应有适当空白和对照。空白是指待测酶反应以外的其他反应（如杂酶、自发反应）引起的变化量，反映未知因素的影响。空白值可通过不加底物、不加酶，或二者都加而预先使酶失效来测定。对照是指用标准酶（或纯酶）测得的结果，与样品酶对照来定量。