理论教育 测定酶活力的方法及单位规定

测定酶活力的方法及单位规定

时间:2023-11-18 理论教育 版权反馈
【摘要】:因此,测定酶活力应以测定其初速度为准。可见,各种酶活力单位是不同的,甚至同一种酶也有不同的活力单位,这在脂肪酶的活力单位规定上表现尤为突出。在酶纯化的步骤中,除了要测定一定体积或一定重量的酶制剂中含有的酶活力单位数,还需测定酶制剂的纯度,酶制剂的纯度一般都用比活力大小表示。

测定酶活力的方法及单位规定

1.酶活力的表征

酶活力(enzyme activity)又称酶活性,是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的高低可用在一定条件下酶催化某一化学反应的速度表示,酶催化反应速度越大,酶活力越高,反之则越低。因此,测定酶活力实际是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物量的减少或产物量的增加来表示。一般情况下,酶促反应体系中底物往往是过量的,测定初速时,底物减少量占总量的比例极少,不易准确测定,而产物则是从无到有,只要能准确测定即可。因此,一般以测定产物的增量表示酶促反应速度较为合适。

将产物浓度对反应时间作图(图6-1),反应速度即为图中曲线的斜率。如图6-1所示,反应速度只在最初一段时间内保持恒定,随着反应时间的延长,酶反应速度逐渐下降。引起反应速度下降的原因有很多,如底物浓度下降,酶在一定pH条件下部分失活,产物抑制效应的产生,产物浓度增大后逆反应加速等。因此,测定酶活力应以测定其初速度为准。这时上述各种干扰因素尚未起作用或影响甚微,速度基本保持恒定。不同酶能维持初速度的时间长度不一,如乳酸脱氢酶为0~30s,脂肪酶为0~15min,脲酶则为0~30min。

图6-1 酶反应速度曲线

2.酶活力的单位

酶活力的大小,即酶量的多少用酶活力单位(U)表示。如上所述,所谓酶活力单位是指某种酶在一定反应条件下,单位时间内被酶催化的底物减少量或产物生成量。如脂肪酶的酶活力单位规定为:在40℃、pH 7.0的条件下,每分钟分解甘油三酯(橄榄油)产生1μmol游离脂肪酸所需的酶量;α-淀粉酶的酶活力单位规定为:在60℃、pH 6.2的条件下,每小时催化1g可溶性淀粉液化所需酶量为1个活力单位,或每小时催化1mL 2%的可溶性淀粉液化所需的酶量为1个酶活力单位。可见,各种酶活力单位是不同的,甚至同一种酶也有不同的活力单位,这在脂肪酶的活力单位规定上表现尤为突出。由于测定方法不同以及不同研究者定义酶活力的不同,造成脂肪酶有10余种活力单位,彼此之间很难进行比较,为后来的研究者带来很大困难。

为此,为便于比较和统一活力标准,1963年国际生物化学联合会酶学委员会曾提出采用统一“国际单位”(IU)来表示酶活力。规定在标准条件下1min内催化1μmol底物的酶量为1个酶活力单位,即1IU=1μmol/min。如果底物有一个以上可被作用的键,则1个酶活力单位规定为1min内使1微克当量(μN)有关基团转化的酶量。上述标准条件是指,温度为25℃,以及被测酶的最适条件,特别是最适pH及最适底物浓度。为了使酶催化活性单位与国际单位的反应速率保持一致,1972年,国际生物化学联合会酶学委员会又推出一个新的酶活力单位,即Katal(Kat,也称为催量)单位。1Kat定义为:在最适条件下,每秒钟可使1mol底物转化的酶量;同样可使1μmol底物转化的酶量为1μKat。以上几种酶活力单位都是可以相互换算的,如式(6-1)所示。(www.daowen.com)

但有时为了研究方便,仍然有很多研究者采用自行规定的酶活力单位,如直接以光密度值(OD600)表示所研究酶的相对活力单位等。

3.酶的比活力

比活力(specific activity)是指每毫克酶蛋白(或每毫克蛋白氮)所含的酶活力单位数。如式(6-2)所示。

比活力是表示酶制剂纯度的一个指标,在酶学研究和提纯酶时常常用到。在酶纯化的步骤中,除了要测定一定体积或一定重量的酶制剂中含有的酶活力单位数,还需测定酶制剂的纯度,酶制剂的纯度一般都用比活力大小表示。一般比活力越高,酶制剂越纯。

4.酶活性中心的转换数

酶活性中心的转换数(turnover number)表示酶催化中心的活性,是指单位时间内每一催化中心(活性中心)所能转换的底物分子数,也可定义为:每摩尔活性中心单位时间内转换底物的摩尔数。实际上,后面讲到的酶催化动力学米氏方程推导中的K3即为转换数。

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