酶的活性以酶分子具有特定活性构象为基础,因此在分离纯化过程中一般应避免使用过于激烈的方法与条件以防止酶的变性、失效。而分离纯化是以得到纯的且有生物活性的酶为目的,在不破坏目标酶的前提下可以采用某些激烈的手段。选择性变性法就是根据酶和杂蛋白在某种条件下稳定性的差别,采用激烈的手段使杂蛋白变性而除去的方法。这种方法是建立在对酶的稳定性有一定了解,而且某些情况下酶的稳定性要远远高于杂蛋白的情况下,也就是充分发挥目标酶的“优势”,使之与杂蛋白分离。
1.选择性热变性(selective heat denaturation)法
如果待分离的酶相当耐热,就可采用这一方法,即在严格控制条件的情况下,将酶溶液迅速升温到某一温度,并保温一定时间,而后迅速冷却,这样,大量不耐热的杂蛋白就将变性析出,通过离心可除去,而酶的总活力损失会很少,同时比活力大大上升。个别酶对热特别稳定,如胰蛋白酶、胰核糖核酸酶、溶菌酶等在酸性条件下甚至可加热到90℃而不破坏,使用这一方法来进行纯化更为有利。
为了使选择性热变性法有更广的适用范围,可在酶溶液进行热处理前,加入该酶的底物、辅酶、竞争性抑制剂、保护巯基的还原剂等,以增大酶和杂蛋白间的耐热性差别。在应用选择性热变性法时,应在预实验中改变处理温度和处理时间,通过酶活回收率和比活力确定最佳处理条件。另外还应该注意严格控制溶液的pH,因为不同pH条件下酶的热稳定性是有差别的,只有在一定pH条件下,才可能使操作具有较好的重现性。同时在样品溶液有蛋白酶污染的情况下,应用此法应特别谨慎。
2.选择性酸碱变性法
如果在一定温度下,目标酶表现出强耐酸性或耐碱性,而这一条件对大多数蛋白质是不稳定的,那么可以将溶液pH严格控制在一定范围内并处理一定时间,同样可达到一定的纯化效果。例如,从麦芽中分离β-淀粉酶,在pH>3时,只有α-淀粉酶失效,但是,pH在3以下时,两种淀粉酶都会失效。(www.daowen.com)
和选择性热变性相比,酸碱变性应用得不多,主要原因可能在于操作较为复杂,条件不易控制,而且纯化效果较差。
3.表面变性法
很早就有人利用酶溶液和惰性液体(氯仿)混合振荡,造成选择性表面变性来制备过氧化氢酶、醇脱氢酶和α-淀粉酶等。振荡处理后通常分成三层:上层为未变性蛋白,中间层为乳浊状变性蛋白,下层为氯仿。这种处理时间通常不宜过长,否则将导致所有蛋白质变性。利用泡沫的形成也可达到选择性表面变性的目的,例如,通氯气到磷酸核糖变位酶和核苷磷酸化酶的溶液中,可使变位酶表面变性而纯化磷酸化酶。之后又有人设计了一种表面变性泡沫分离器,用于回收有效成分以进行酶的纯化。
应用表面变性法时须控制的因素很多,除了泡沫大小以及泡沫形成的速度外,pH和温度也十分重要。和酸碱变性法一样,它的应用范围远不如选择性热变性法广。
总之,选择性变性法灵活性很大,如果发挥得当,可能大大地提高酶的纯度。成功的关键在于严格控制条件,除了所选用的主要因素外,还需注意其他因素,其中也包括蛋白质的浓度,蛋白质浓度太低时,一般不宜应用此法。
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