（一）吸附层析

1.原理

吸附作用是物体表面的一个重要性质，理论上任何两相都可以形成界面，其中一相的物质或溶解在其中的溶质在另一相表面上发生密集行为，称之为吸附。溶质从溶液中到停留在固体表面上的过程，称为吸附现象。溶质的密集行为发生在固体与气体之间称为固—气吸附，发生在固体与液体之间称为固—液吸附，发生在液体与气体之间称为液—气吸附。凡是能够将其他物质聚集到自己表面上的物质称为吸附剂，能聚集于吸附剂表面的物质称为被吸附物。吸附剂一般是固体或者液体，在吸附层析中通常采用固体吸附剂。

固体物质之所以具有吸附作用，是由于固体表面的分子（原子或离子）与固体内部的分子所受到的作用力不同。固体内部的分子受到的是分子间的作用力，大小和方向是对称的。而固体表面的分子所受到的作用力不对称，其向内的一面受固体内部分子的作用，作用力比较大，向外的一面受力较小。当气体或液体中的溶质分子在运动过程中碰到固体表面时，就会被吸附而停留在固体表面上。

吸附剂与被吸附物之间的相互作用力主要是范德华力。其特点是可逆的，即在一定条件下，被吸附物被吸附到吸附剂的表面，而在另外某种条件下，被吸附物可以离开吸附剂表面，称为解吸作用。

2.吸附剂的选择

根据同性相吸原则，极性物质容易被极性表面吸附；非极性物质容易被非极性表面吸附；溶液中溶解度越大的物质越难被吸附。

吸附剂的种类很多，可以分为无机吸附剂和有机吸附剂。吸附剂通常由一些化学性质不活泼的多孔材料制成，比表面积大。常用的吸附剂包括硅胶、活性炭、磷酸钙、碳酸盐、氧化铝、硅藻土、泡沸石、陶土、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖、琼脂糖、菊糖、纤维素等。此外，还可以在吸附剂上连接亲和基团而制成亲和吸附剂。通常用于酶的分离纯化的吸附剂有硅藻土、氧化铝、磷酸钙、羟基磷灰石和活性炭等。这些吸附剂一般在较低pH和低离子强度的条件下对酶有较强的吸附作用，而在提高pH和增加离子强度的条件下，酶可被解吸而洗脱下来。

3.洗脱剂的选择

同理，对于极性组分，用极性大的溶剂洗脱效果较好；而对于非极性组分，则用非极性溶剂洗脱为佳。洗脱剂的种类有：饱和烃、醇、酮、酚、醚、卤代烷、水等。常用的洗脱剂按其极性增大的顺序排列如下：石油醚、环己烷、四氯化碳、三氯乙烯、甲苯、苯、二氯甲烷、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丙醇、甲醇、水、吡啶、乙酸等。

吸附层析是亲和层析的基础，在吸附剂上挂上专一性的吸附基团就可转化为专一的亲和层析。

（二）亲和层析

生物物质，特别是酶和抗体等蛋白质，具有识别特定物质并与该物质的分子相结合的能力，这种识别并结合的能力具有专一性、排他性，并且生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合（图5-14）。这种特异性的相互作用称为生物亲和作用（bio-affinity）。利用生物分子间的这种特异性结合作用而进行的分离纯化技术称为亲和纯化技术。

图5-14 亲和层析原理

亲和层析是亲和纯化技术中最为典型和常用的一种方法。酶和它的底物、底物类似物或竞争性抑制剂等通常都具有较高的生物亲和力，能专一地形成酶—配基络合物，而且这种结合是可逆的。亲和层析就是将这类能与酶发生结合的配基通过偶联反应固定于层析柱料载体上，当样品流过层析柱时，目标酶被迅速吸附于层析柱上，而杂蛋白则在此过程中随缓冲液流出，而后可以通过在洗脱液中加入亲和力更强的配基，通过竞争作用使酶与配基解离，也可通过改变条件促进层析系统的解吸，选择性地将酶从亲和吸附柱上分离下来。

亲和层析法的操作与离子交换相似，包括吸附和洗脱两个主要步骤，但亲和层析所用的柱料因其有较高的专一性，往往需要选择和制备，而洗脱的方法也更加灵活。下面就柱料的制备和洗脱方法进行介绍。

1.柱料的制备

用于亲和层析的柱料包括载体和配基两部分。对于载体，首先必须是亲水且结构疏松，以便于待纯化分子自由地与配基接触；其次必须具有大量可以与配基发生偶联反应的基团，而且尽可能少地与杂蛋白发生非专一性吸附；最后要求载体稳定性好，要经得起操作过程中各种pH、离子强度、温度变化的考验，并满足操作对流速的要求。常见的载体有聚苯乙烯衍生物、纤维素、微孔玻璃、葡聚糖凝胶等。

对于配基的设计应是建立在对酶的结构有一定了解的基础上，多采用一些“族”专一性的配基。配基和待纯化的酶分子之间，亲和力的强度应适中，若作用力太强，结合太紧，解吸就会困难，可能需要十分激烈的条件才能洗脱；而结合力太弱，则很难达到完全专一吸附的目的。除了能与酶蛋白结合基团外，配基还应具有与载体偶联固定的活泼基团，而且与固相载体的结合不会影响或破坏配基和酶间的相互作用。

选择了合适的载体和配基后，应将配基偶联于载体。而在进行偶联之前，往往需要在配基与载体间加上一段短“臂”，如图5-15所示。这是因为以直接偶联方式得到的亲和吸附剂，往往由于配基和载体间距离太近，而酶的活性部位一般又都埋藏在酶分子的深部，因此待纯化酶的结合基团和配基间无法表现亲和作用，通过加“臂”消除了这种空间位阻效应，使配基和待纯化酶的结合基团能较好地接近，以改善亲和吸附效果。(www.daowen.com)

图5-15 配基与载体间的短“臂”在亲和吸附中的作用

2.洗脱

洗脱以能削弱酶与亲和吸附剂间的相互作用为目的，可以采用的方法很多，下面举例说明。

（1）改变温度 由于溶质从液相吸附到惰性固相载体的过程是一个放热过程，因此，升高温度能使吸附平衡移向解吸方向。而且，吸附过程放热越大，随着温度升高越易被洗脱。因此，通过线性温度梯度洗脱就可将不同的蛋白质分别洗脱下来。这种洗脱方法的优点是洗脱液中不需要加入盐类等外来因素。

（2）改变pH和离子强度 亲和吸附中有一种重要的作用力是静电键，因此，在洗脱时，改变pH有可能使酶和配基间原有的吸引力转变为排斥力，从而达到选择性解吸洗脱的目的，但是选择的pH应不影响酶的稳定性。另一方面也可通过提高介质的离子强度，在吸附剂与酶间造成离子屏蔽来削弱静电作用力；同上述改变温度一样，这种洗脱方法也属于非专一性洗脱。

（3）变性、断裂和降解 在常用的洗脱方法无能为力或无法采用时，可以选择较激烈的变性手段。例如，可以在洗脱液中加入变性剂盐酸胍等，在低pH条件下使被吸附的酶构型发生可逆改变而解吸下来。但是，这种洗脱方式可能导致酶的不可逆失效，而且即使是可逆变性，随时间延长也可能向不可逆转化，故在洗脱后应立即除去变性剂。

（4）专一性洗脱 利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，洗脱目标酶。进行这种洗脱时，常采用半抗原、底物类似物、竞争性抑制剂、辅助因子或其他能与被吸附的成分有特殊亲和力的物质。洗脱方式通常为通过升高亲和洗脱剂浓度进行梯度洗脱，或者用几种解吸附剂进行脉冲洗脱。专一性洗脱选择性高，但洗脱的稀释度也较大，而且即使提高洗脱剂的浓度也不能有大的改善。图5-16所示为一种典型的亲和分离洗脱图。

图5-16 典型的亲和分离图谱

（三）亲和膜（affinity membrane）

亲和膜利用亲和配基修饰的微滤膜为亲和吸附介质，进行亲和纯化目标酶，是固定床亲和层析的变形。传统的固定床层析是利用多糖凝胶或硅胶等的多孔粒子为固定相，床层压降随流速线性增大，而且易发生压密现象，在较高压力下，流速随压力的升高而下降，所以层析操作的速度受到很大限制。柱层析多采用径向放大的方式提高处理量。在柱体积一定的情况下，将柱子做成“短粗”形利于提高分离速度，而这个短粗形状的极限就是微孔膜，膜厚就是床层高度。这种亲和膜在原理和操作上与亲和层析并无太大差别，但却有自己的优点：传质阻力小，达到吸附平衡的时间短，配基利用率高；压降小，流速快，设备体积小，配基用量低等。但是也存在分辨率低、膜易污染等缺点。

（四）亲和沉淀（affinity precipitation）

亲和沉淀是生物亲和相互作用与沉淀分离相结合的蛋白质分离纯化技术。根据亲和沉淀的机制不同，分为一次作用亲和沉淀和二次作用亲和沉淀。

（1）一次作用亲和沉淀 水溶性化合物分子上偶联有两个或两个以上的亲和配基，前者称为双配基，后者称为多配基。双配基或多配基可与含有两个以上亲和部位的多价蛋白质产生亲和交联，进而增大为较大的交联网络而沉淀。

（2）二次作用亲和沉淀 利用一种特殊的载体固定亲和配基，来制备亲和沉淀介质，这种载体是一种在物理场（如pH、离子强度、温度和添加金属离子等）改变时溶解度下降，发生可逆性沉淀的水溶性聚合物。亲和介质结合目标酶分子后，通过改变物理场使介质与目标蛋白共同沉淀的方法称为二次作用亲和沉淀。利用上述机制进行亲和沉淀后，离心或过滤回收沉淀，即可除去未沉淀的杂蛋白，沉淀经过适当清洗或加入洗脱剂即可回收纯化的目标产物。

亲和沉淀具有如下优点：配基与目标酶的亲和结合是在自由溶液中进行的，无扩散传质阻力，结合迅速；亲和配基裸露在溶液中，可以更有效地与酶结合，使配基利用率提高；容易规模放大；适用于高黏度或含有微粒的处理液。

（五）反相层析

反相色谱层析是基于各蛋白质或小分子肽与色谱介质疏水表面的可逆作用来达到分离效果的。样品被结合在柱子上，随着条件的改变各成分被逐次洗脱而分开。由于反相矩阵的自身性质，样品和介质之间的结合是十分牢固的，洗脱时经常要用到有机溶剂和其他添加剂（如离子配对剂等）。通常洗脱是靠逐渐增大有机溶剂的浓度来实现的，最常用的有机溶剂是乙腈。样品在结合和洗脱分离的过程中被浓缩和纯化。关键的分离步骤如图5-17所示。

图5-17 典型的反相层析梯度洗脱图谱

反相层析技术通常适用于核酸片断或肽段的最后精制阶段。对于蛋白质纯化，如果要求复原活力和结构区域正确，不建议使用该技术，因为大部分蛋白质在有机溶剂中都会失活变性，只有少数蛋白质可以幸免，故在此只简略介绍反相层析。