（一）离子交换吸附

1.原理

离子交换作用是指在固定相和流动相之间发生的可逆的离子交换反应，离子交换原理如图5-10所示。蛋白质的离子交换过程分为两个阶段：吸附和解吸附。吸附在离子柱上的蛋白质可以通过改变pH或增强离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争离子交换剂上的电荷位置，从而使吸附的蛋白质与离子交换剂解离。不同蛋白质与离子交换剂形成的键数不同，即亲和力大小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件就可将蛋白质混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。

图5-10 离子交换原理

2.离子交换剂

离子交换剂的母体是一种不溶性高分子化合物，如树脂、纤维素、葡聚糖等，它的分子中引入了可解离的活性基团，这些基团在水溶液中可与其他阳离子或阴离子起交换作用。

按照母体的不同可分为以下三类。

（1）离子交换树脂 是以聚苯乙烯树脂等为母体，再导入相应的解离基团而成，具有疏水的基本骨架，易导致蛋白质变性，交换容量也低，一般只有以羟基为解离基团的弱酸性树脂，个别对酸碱较稳定的酶也曾用强酸型或强碱型的交换树脂，但很少。近年来大孔型交换树脂的出现，可能使这种交换剂的应用范围有所扩大。

（2）离子交换纤维素 是目前酶的纯化工作中用得较多的交换剂，它是以亲水的纤维素为母体，引入相应的交换基团后制成。优点是交换容量较大，交换速度也较高；缺点是易随交换介质的pH、离子强度改变而发生膨胀、收缩，同时粒子较细，柱层析时流速小。

（3）离子交换凝胶 以葡聚糖凝胶或琼脂糖凝胶为母体，导入相应的交换基团后制成。它的应用日益增多，优点是交换容量较离子交换纤维素大，同时具有分子筛的作用；和纤维素一样，缺点也是易随缓冲液pH和离子强度的不同而改变其交换容量、容积和流速。

按照离子交换基的不同又可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂，按照结合力的不同可分为强离子交换剂和弱离子交换剂。

能与阳离子发生离子交换的称为阳离子交换剂（cation exchanger），其活性基团为酸性；能与阴离子发生交换作用的称为阴离子交换剂（anion exchanger），其活性基团为碱性。解离基团为强电离基团的称为强离子交换剂，而带有弱解离基团的称为弱离子交换剂。应根据所吸附的蛋白质的性质来选择交换剂种类。如，羧甲基是弱酸性阳离子交换剂，磺酸基是强阳离子交换剂。因为对于酸性的质子，硫酸盐的pK比乙酸盐的低。阳离子蛋白质与两种交换剂均能结合，但要从强离子交换剂中将蛋白质解析下来，通常需要较高浓度的平衡离子。类似的，二乙氨基乙基（DEAE）是弱碱性阴离子交换剂，季铵离子是强阴离子交换剂。表5-8所示为目前比较常用的几种离子交换剂。

表5-8 蛋白质纯化常用的几种离子交换剂及其性质

3.操作过程

这类分离方法可采用静态方式，也可采用层析方式，而以层析方式操作为多。其装置与前面所述的凝胶层析装置类似。其操作过程一般包括三个关键环节：加样吸附、洗涤和洗脱，其中每一个环节都包含着目标蛋白（或酶）和杂蛋白的分离。

（1）加样 用缓冲液将柱料充分平衡后，即可上样，由于吸附过程是靠离子键的作用，所以这一过程能够瞬时完成，加样时流速并没有苛刻要求。

（2）洗涤 在与加样条件相同的情况下，使相同的缓冲液继续流过层析柱，洗脱一些通过非离子键作用吸附的滞留在柱中的杂蛋白，以提高分离效果。

（3）洗脱 当洗脱液中加入一定浓度的盐（多采用氯化钠）时，蛋白质即可与离子交换剂发生解离，主要有三种洗脱法，即恒定溶液洗脱、批次洗脱和梯度洗脱。

恒定溶液洗脱时，样品体积应控制在床体积的1%～5%。层析柱应细长些，高径比为20左右，这种方法所用的洗脱液体积往往比较大。

批次洗脱指用几个不同浓度梯度的盐溶液逐次洗脱；而梯度洗脱借助梯度混合仪使洗脱液中的盐浓度成线性升高，其工作原理如图5-11（1）所示。右侧容器装有低浓度盐溶液，左侧容器中为高浓度盐溶液，开始洗脱时，洗脱液中盐浓度与低浓度相同，并且呈直线上升，至最后一滴洗脱液时其盐浓度与左容器中盐浓度相同。如图5-11（2）所示：随着洗脱液中离子强度的增加，蛋白质与凝胶上的解离基团之间的作用力逐渐降低，并且不同的蛋白由于结合力不同，而分别洗脱下来。用这两种洗脱方式时，柱的长度可以短些（20～40cm），高径比为5左右。一般来说，梯度变化太快，分辨率下降；而变化过慢，洗脱液被稀释，洗脱时间也增加。所以应控制总洗脱体积为床体积的5倍左右。也可找出能使待分离蛋白不与离子交换剂相互作用，而大部分杂蛋白则被吸附的条件。这样就有可能使样品通过离子交换剂得以过滤，并保留未吸附的物料，弃去被吸附的杂蛋白质。这在少数情况下也不失为一个有效的方法。

图5-11 梯度混合仪工作原理（1）及梯度洗脱原理（2）

4.离子交换剂的选择

（1）选择阳离子交换剂还是阴离子交换剂 因为酶蛋白质是两性电解质，处于不同的pH时，可以带正电，也可以带负电，因此既可选用阳离子交换剂，也可选用阴离子交换剂。在这种情况下，一个重要的决定因素就是酶的稳定性，也就是说，如果目标酶在低于其pI（等电点）的pH条件下更稳定，应选用阳离子交换剂，如果目标酶在高于其pI的pH条件下更稳定，宜采用阴离子交换剂。

（2）选择强型交换剂还是弱型交换剂 如果目标酶既可以应用强型交换剂，也可以应用弱型，那么应优先考虑选择弱型。但如果目标酶pI＜6或pI＞9，则应考虑强型交换剂，因为只有强型交换基团能在广泛的pH范围内保持完全解离状态，而弱型交换基团适用的pH范围较窄，多数弱型的阳离子交换剂在pH＜6或弱型阴离子交换剂在pH＞9时不带电荷，已经失去交换能力。DEAE的pK为9.5，当pH＞9时，应改用QAE和TEAE。而CM的pK约为4，当pH＜3时，应改用SE或SP作为交换剂。

如果要分离的蛋白质需要很高浓度的盐才能洗脱下来，可以改换较弱的离子交换剂。改变pH也可能解决问题，对于阳离子交换，提高pH将会降低洗脱蛋白质所需的盐浓度；对于阴离子交换，则降低pH会产生类似的效果。相反，如果要分离的蛋白质即使在很低的离子强度下也不能被交换剂所保留，那就要用较强的交换剂或调节pH。

（3）流速 不同柱料对流速有不同要求，应予以注意。纤维素的流速一般低于凝胶，Sepharose交换剂兼有高流速和高交换容量的优点。离子交换剂在使用前都必须进行预处理，以除去各种可溶性杂质，并将交换基团变成适当的交换剂。新的交换剂应先在蒸馏水中充分膨润，然后再用酸、碱反复处理。

（4）交换容量 交换容量是单位质量的干燥离子交换剂或单位体积的湿离子交换剂所能吸附的一价离子的毫摩尔数，是表征离子交换能力的主要参数。然而蛋白质与小分子化合物的离子交换特性有很大差别：蛋白质分子质量大，树脂孔道对其空间排阻作用大，不能与所有的离子交换活性中心接触；离子交换吸附的蛋白质分子会妨碍其他蛋白质与未吸附蛋白质的离子交换基团作用；蛋白质带多价电荷，在离子交换中一般可与多个离子交换基团发生作用。因此，蛋白质的交换容量远远低于无机离子的交换容量。

5.缓冲液的选择

缓冲液的选择原则是不与柱料相互作用，即阳离子交换剂用阴离子缓冲液，阴离子交换剂用阳离子缓冲液，否则缓冲液离子要参与离子交换反应，影响溶液的pH稳定。例如，阴离子交换剂选用Tris缓冲液，则阳离子交换剂选用磷酸缓冲液。否则缓冲离子与交换剂相结合会发生问题。而有些缓冲液的官能团有兼性离子特征，例如HEPES缓冲液，在pH为7.4时，既可用于阴离子交换层析，也可用于阳离子交换层析。(www.daowen.com)

缓冲液还要选择合适的离子强度，为了让杂蛋白“穿过”或不吸附于柱料而获得显著的纯化效果，不一定在无盐的条件下加样，初始离子强度可以通过实验确定，在选定缓冲液及其pH的条件下，在不同的离子强度下，用静态的方法使蛋白液与柱料结合一段时间后，测上清液中的酶活力。一般低离子强度利于蛋白质与柱料的结合，当盐浓度提高到一定值时，上清液中开始出现酶活，应选择刚刚低于洗脱该蛋白质所需的离子强度作为初始离子强度。实际上，选比洗脱点低至少0.1mol/L的盐浓度是合适的。

缓冲液的pH和离子强度的选择原则是开始加样时的条件应尽可能接近洗脱条件。对于蛋白质来说，缓冲液的pH与蛋白质的等电点相差一个单位，往往取得较好效果。

6.离子交换的特点

离子交换吸附法在应用上是目前仅次于盐析的一种纯化方法。它适用面广，几乎所有的蛋白质都可以分离；具有很高的分辨率；可以处理大体积的样品，从而避免浓缩的步骤；用这种方法制备蛋白质可以节省时间，而且一般总得率较高。

（二）电泳（electrophoresis）

这是根据各种蛋白质在解离、电学性质上的差异，利用它们在电场中的迁移方向与迁移速度的不同进行纯化的一类方法。

根据电泳所用的技术可分为显微电泳、免疫电泳、密度梯度电泳、等电聚焦电泳等。根据电泳的方向可分为水平电泳和垂直电泳。根据电泳的连续性可分为连续性电泳和不连续性电泳。根据有无支持物可分为自由界面电泳（free electrophoresis）和区带电泳（zone electrophresis）。自由界面电泳是利用胶体溶液的溶质颗粒经过电泳以后，在溶液和溶剂之间形成界面，从而达到分离的目的。区带电泳是样品在惰性支持物上进行电泳的过程，因为有支持物的存在减少了界面之间的扩散程度和干扰的发生，而且多数支持物还具有分子筛的作用，提高了电泳的分辨率。区带电泳简单易行，成为目前应用较多的重要电泳技术。区带电泳根据所用支持物的不同又分为纸电泳、琼脂糖凝胶电泳以及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。下面是几种比较常用的电泳方法。

1.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）

聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常用的电泳方法，这种电泳具有分子筛效应，因而可达到很高的分辨率。常用的聚丙烯酰胺凝胶电泳以不连续方式进行，也就是电泳的胶与缓冲体系都具有不连续性，称为disc电泳。由于它的不连续性导致样品在电泳分离过程中被浓缩成圆盘状薄层，从而显示很高的分辨率。这种电泳由三部分组成：样品胶和成层胶，它们的孔径与缓冲介质相同；分离胶，孔径较前两者小。胶中孔径的缓冲离子由于易解离、迁移率大，故称为先行离子；电极液缓冲离子在样品胶和成层胶的pH条件下，迁移率慢，故称为尾随离子，而样品在样品胶与成层胶中的迁移率通常介于先行离子和尾随离子之间。

电泳开始后，先行离子超前流动，并在它的后面留下一低离子浓度的低电导区。这种低电导区导致高电位梯度的产生，迫使尾随离子加速泳动，在高、低电位区间构成迁移快的界面，同时样品离子被压缩于界面中形成圆盘状薄层。由于样品中各组分所带的电荷不同，迁移率也不同，所以这种圆盘状薄层实际是样品中各组成成分相对应的亚圆盘薄层按迁移率堆叠而成的。当样品离子和尾随离子进入分离胶后，由于其间的pH有利于尾随离子的解离，故它的迁移率显著增大，并迅速超过样品离子，导致高的电位梯度消失，样品开始在具有均一电场的分离胶中按照解离状况接受电泳分离。由于分离胶孔径较小，样品同时受到分子筛效应的控制，静电荷相同的蛋白质也能得到进一步分离，故而分辨率高。为了进一步提高其分辨率，又发展了SDS-聚丙烯酰胺胶电泳等。十二烷基硫酸钠（SDS）是一种阴离子去垢剂，它能与蛋白质结合，破坏蛋白质分子内部和分子间以及与其他物质间的次级联系，使蛋白质变性；通常每克蛋白质约能结合1.4gSDS，从而使蛋白质所带的负电荷远超过蛋白质原有的电荷数，消除不同蛋白质原有的荷电差异；再加上结合了SDS的蛋白质都是椭圆状，没有大的形状差异，因此蛋白质电泳迁移率仅取决于蛋白质的分子质量。所以，SDS-PAGE能用于而且主要用于蛋白质的纯度分析和分子质量测定。图5-12所示为巴伦葛兹类芽孢杆菌几丁质酶纯化过程中的蛋白质SDS-PAGE分析图。

图5-12 巴伦葛兹类芽孢杆菌几丁质酶纯化过程中的蛋白质SDS-PAGE分析图

M—标准蛋白

1—粗酶液 2—凝胶过滤后样品 3—离子交换后纯酶 4—酶谱图

2.等电聚焦电泳（isoelectric focusing）

等电聚焦电泳是利用蛋白质为两性电解质具有等电点，处于等电点的pH时呈电中性，不发生泳动的特点进行的电泳分离。在电泳设备中首先调配连续的pH梯度，然后使蛋白质在电场作用下泳动到与各自等电点相等的pH区域而不再继续泳动，从而形成具有不同等电点的蛋白质区带。

这种技术的关键是调配稳定的连续pH梯度。一般采用氨基酸混合物或氨基酸聚合羧酸的缓冲液。如已经商业化的载体Ampholine为数百种组分的混合物，各组分具有不同的等电点，一般有三种pH梯度范围供选择：pH4～6，pH8～10，pH9～11。

一般的电泳容易受溶质扩散的影响而影响分离效果，而等电聚焦电泳不存在这个问题，因此它的分离性能极高。但也存在一些缺点，如：载体两性电解质对产品产生污染；pH梯度的稳定性不高；操作过程容易发生凝胶脱水起皱等现象。

3.毛细管电泳（capillary electrophoresis）

毛细管电泳利用毛细管为电泳装置，其内径为25～200μm，长度约为100cm，壁厚约为200μm。毛细管电泳有如下特点：电泳管道微细，可有效抑制电泳操作过程中对流和混合的发生，分离精度高；毛细管的比表面积大，设备的冷却比较容易；因毛细管的散热速度快，所以操作电场强度可达100～300V/cm，电泳速度快，分离时间短；加样量少（不足1μL），样品浓度可以很低，10^-4mol/L即可。毛细管电泳是近年来发展很快的一种分析分离技术。

（三）聚焦层析（chromatofocusing）

等电聚焦法虽然分辨率很高，但这种方法操作困难，而且需要特殊电泳装置。近年来发展了一种聚焦层析法，它是将层析技术的操作方法与等电聚焦的原理相结合，兼有等电聚焦电泳分辨率高和柱层析操作简便的优点。

原理：当用特种的缓冲液滴定和淋洗填装在层析柱中的特种多缓冲交换剂时，随着这种缓冲液的扩展，会在层析柱中自上而下地建立起连续的pH梯度；将待纯化样品加入该层析柱，其中的蛋白质组分就将随着多缓冲液的扩展按各自的等电点聚焦于相应的pH区段，并随扩展过程中pH梯度的逐渐下降，最后分别从层析柱先后流出，达到分离纯化的目的。因此，这一方法的关键是一方面要选用适当的多缓冲交换剂和多缓冲液，以便在层析柱中形成pH梯度；另一方面也要使被分离的各蛋白质组分在多缓冲液扩展时能按各自的等电点分别聚焦到相应的pH区段上。

（四）疏水层析（hydrophobic interaction chromatography, HIC）

1.原理

疏水层析是以表面偶联有弱疏水性基团的疏水性吸附剂为固定相，根据蛋白质与疏水性吸附剂之间的弱疏水性相互作用的差别进行蛋白质分离纯化的洗脱层析法。蛋白质通常含有被掩藏于内部的疏水残基，只有当蛋白质部分变性时，这些区域才与本体溶剂接近。但在蛋白质的表面也有一些疏水补丁（hydrophobic patches），它们能与非极性部分相互作用而不会变性。增加盐的浓度能促进这些表面的疏水作用，即使可溶性很好的亲水蛋白质也能被迫与疏水物质结合从而吸附于固定载体上，只要通过降低流动相的离子强度就可以逐次洗脱吸附的蛋白质而达到分离的目的。

2.特点

疏水层析主要用于蛋白质类生物大分子的分离纯化。由于在高浓度盐溶液中疏水性吸附作用较大，因此疏水层析可直接分离盐析后的蛋白质溶液；可通过调节疏水配基链的长度和密度来调节吸附力，因此可根据目标产物的性质选择吸附剂；以依赖于盐的方式利用蛋白质表面的疏水性质，避免了蛋白质在有机溶剂中的变性；疏水性吸附剂种类多，选择余地大，价格与离子交换剂相当。图5-13所示为比较典型的疏水层析梯度洗脱图。

图5-13 典型的疏水层析梯度洗脱图谱