利用分子大小差异建立的纯化方法为凝胶过滤（层析）法（gel filtration chromatography, GFC）。

1.原理

凝胶过滤通常以柱层析的方式进行。柱中填充的分子筛介质，是具有一定孔径的球状凝胶物质，常用于生物大分子的分离。

凝胶过滤法的原理如图5-6所示。层析柱中装入适当孔径的凝胶物质以后，加入待纯化样品，再用适当的溶剂或缓冲液使样品在柱中自上而下扩展。这样，样品中的各种蛋白质分子将按其分子大小表现不同的层析状态而分离。大于凝胶孔径的分子由于不能进入胶粒内部，只能沿胶粒间隙扩展，走的是一条较“短”的“近路”，表现出较快的移动速度；反之，小于凝胶孔径的分子，由于它们能自由进出胶粒内外，走的是一条“长而曲折”的“远路”，表现为较慢的下移速度。所以，待纯化样品通过一定长度的层析柱后，不同大小的分子都将按先后顺序依次流出，彼此分开，达到纯化目的。由于某些分子被排阻在胶粒外，故这种层析又称为凝胶排阻层析（gel exclusion chromatography）。

图5-6 凝胶过滤原理

2.操作过程

柱层析的操作一般包括如下环节：层析介质的平衡、装柱、加样、扩展（包括洗涤和洗脱）以及与此同时进行的流出液成分（蛋白质或酶活性）的检测和分部收集。

商品凝胶必须经充分溶胀后才能应用，否则影响分离效果。将干燥凝胶加水或缓冲液，在烧杯中搅拌、静置，倾去上层混悬液、去除过细粒子，反复数次，直至上层澄清为止。一般的凝胶需浸泡2d，加热煮沸能加速溶胀过程。装柱后，上样前要用缓冲液充分洗涤，使溶剂和凝胶达到平衡，这一过程往往需要8h。扩展时需控制合适的流速，商品凝胶一般有各自的推荐流速，基本在0.1～0.3mL/min范围内。另外，应保证流速稳定。

目前流出液中蛋白质的检测主要依靠核酸蛋白质检测仪，即在线检测流出液在260～280nm处的吸光值，对于酶液还可以通过离线检测酶活力，以确定目标酶的出峰时间（图5-7）。

图5-7 典型的凝胶过滤洗脱图谱

3.凝胶的选择

最常用的凝胶有如下几种：葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。上述各类凝胶都有很高的亲水性，能在水中膨润。膨润后的凝胶具有一定的弹性和硬度，并有很高的化学稳定性，在盐和碱溶液中都很稳定，可应用pH范围为4～9；但是，如果在pH 2以下的酸性条件下长时间处理，则有被水解破坏的可能。此外，它们对氧化剂也较敏感。上述凝胶都没有易于解离的基团，因此很少发生非专一吸附。如表5-4所示为目前比较常用的几种凝胶介质。

表5-4 常用的商品化凝胶过滤介质

表征凝胶特性的参数主要有以下各项。

（1）排阻极限 指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。不同的凝胶过滤介质有不同的排阻界限，具体数值见表5-5。

表5-5 各种葡聚糖凝胶的特性

（2）分级范围 指能被凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质相对分子质量范围。不同孔径大小的凝胶过滤填料适用于分离分子质量不同的蛋白质。分离大蛋白质必须用孔径较大的凝胶，反之，分离较小的蛋白质最好选用孔径较小的凝胶。

（3）分辨率 凝胶颗粒大小均一性越好，分辨率越高，颗粒越小，分辨率也越高。因此，为获得高分辨率，需要颗粒小而均一的凝胶。然而这样的凝胶往往比较昂贵，且需较高的层析压力。(www.daowen.com)

（4）床体积 即1g干燥凝胶溶胀后所占有的体积。Sephadex G50的床体积为9～11cm³/g干胶。凝胶的床体积可用于估算装满一定体积的层析柱所需的干燥凝胶量。

（5）流速 凝胶颗粒对中等强度的压力可能较为敏感。如果颗粒被蛋白质或缓冲液产生的压力压紧或压碎，而后压碎的颗粒会阻止后来的缓冲液通过层析柱，使颗粒压得更紧，更多的凝胶被破坏，从而造成蛋白质丢失。因此需要能耐高压的凝胶。一般来说，用孔径较大的凝胶时，其流速应低于孔径较小、较结实的凝胶。此外，许多凝胶由交联的复合材料组成以增加它们的强度。大多数厂商会提供有关流速的资料，但要注意这是针对水质缓冲液而定的，如果缓冲液中有10%的甘油，最好把流速降低到推荐流速的50%，以补充该缓冲液的附加黏度。

（6）空隙体积 指层析柱中凝胶之间空隙的体积，这一数值可用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定，一般使用平均分子质量为2000kDa的水溶性蓝色葡聚糖（blue dextran）。以琼脂糖凝胶和葡聚糖凝胶最为常用。Sephadex G是利用葡聚糖加交联剂制备而成的凝胶，是最传统的软凝胶之一，这一系列凝胶的具体特性见表5-5。Sepharose是常用的琼脂糖凝胶品牌之一，机械强度低，而Sepharose CL是利用环氧丙烷交联制备的，机械强度较普通Sepharose高。TSK凝胶是利用亲水性合成高分子制备的凝胶过滤介质，有较高的机械强度，其中HW系列为半刚性凝胶，适用于中压液相层析，PW系列机械强度更高，适用于高压液相层析。Superdex凝胶是将葡聚糖共价交联到高度交联的琼脂糖球体上制备的刚性凝胶。

4.凝胶的再生

在每次分离过程结束后，凝胶由于本身没有什么变化，一般不需要特殊的处理，只需蒸馏水、稀盐或缓冲液充分洗涤后又可继续使用。经洗净的凝胶，通常以膨润状态置入冷冻室中长时间保存，有时为了防止微生物污染，需加入抗菌剂，也可保存于20%的乙醇溶液中。

5.样品

凝胶过滤（层析）法对样品浓度没有太严格的要求，但浓度高时利于提高分辨效率。若样品中含有黏性成分则可能导致分离效果变差。样品体积对分离效果的影响很大，应该尽可能小，一般不超过柱体积的2%。

6.洗脱液

洗脱液的组成一般不直接影响过滤效果，通常荷电蛋白质可用磷酸盐之类的缓冲液，离子强度应控制在0.02mol/L左右，pH由酶的稳定性和溶解度决定。如果层析产品接下来要进行冷冻干燥，则可采用挥发性的缓冲液。

7.凝胶过滤的其他应用

凝胶过滤除了用于蛋白质分离以外，还有其他用途。

（1）脱盐 这一点在本章上一节中已经涉及，而且也可用于溶解目标产物的缓冲液的交换。

（2）相对分子质量的测定 在凝胶过滤介质的分级范围内，蛋白质的分配系数与相对分子质量的对数成正比，故凝胶过滤（层析）法可用于蛋白质相对分子质量的测定。

8.特点

（1）分离机制简单，操作参数少，容易规模放大。

（2）溶质与介质不发生任何形式的相互作用，不受pH、盐和温度等的影响，操作条件温和，产品回收率可接近100%。

（3）凝胶无需特殊的再生处理即可重复利用，适用于各种分子的分离。