（一）盐析法

1.原理

向蛋白质的水溶液中加入中性盐，可以产生两种影响：一种是盐离子与蛋白质分子中的极性或离子基团作用，降低蛋白质分子的活度系数，使其溶解度增加。在盐浓度较低时以这种影响为主，称为盐溶（salting in）现象。另一种是盐离子与水这种偶极分子作用，使水分子的活度降低，导致蛋白质水合度降低，蛋白质溶解度下降，在盐浓度较高时这种影响起决定作用，蛋白质会沉淀，称为盐析（salting out）现象（图5-2）。

图5-2 盐溶和盐析现象示意图

盐析纯化法是根据酶和杂蛋白在高盐浓度的溶液中溶解度存在差别，而能够依次分别沉淀的原理而建立的一种纯化方法。

在盐析条件下，蛋白质的溶解度与溶液的离子强度之间关系如式（5-1）所示。

式中 S——酶或蛋白质在离子强度为I时的溶解度，g/L

S ₀——酶或蛋白质在离子强度为0时（即在纯溶剂中）的溶解度，g/L

K _s——盐析系数

I——离子强度

在温度和pH一定的条件下，S₀为一常数。所以上式可以改写如式（5-2）所示。

式中 β——logS₀，主要决定于酶或蛋白质的性质，也与温度和pH有关，当温度和pH一定时，β为一常数

K_s——盐析系数，主要决定于盐的性质。K_s的大小与离子价数成正比，与离子半径和溶液的介电常数成反比，也与酶或蛋白质的结构有关

不同的盐对某一种蛋白质具有不同的盐析系数。同一种盐对于不同的蛋白质也有不同的盐析系数。

对于某一种具体的酶或蛋白质，在温度和pH等盐析条件确定（即β确定），所使用的盐确定（即K_s确定）之后，酶或蛋白质在盐溶液中的溶解度取决于溶液中的离子强度I。

离子强度I是指溶液中离子的强弱程度，与离子浓度和离子价数有关，如式（5-3）所示。

式中 m_i——离子强度，mol/L

Z _i——离子价数

例如，0.2mol/L的（NH₄）₂SO₄溶液，其中，铵离子浓度为2×0.2mol/L，价数为+1；硫酸根离子浓度为0.2mol/L，价数为+2；离子强度为：

I=1/2×（2×0.2×1²+0.2×2²）=1/2×（0.4+0.8）=0.6

对于含有多种酶或蛋白质的混合溶液，可采用分段盐析的方法进行分离纯化。

在一定温度和pH条件下（β为常数），通过改变离子强度使不同的酶或蛋白质分离的方法称为K_s分段盐析；而在一定的盐和离子强度的条件下（K_sI为常数），通过改变温度和pH，使不同的酶或蛋白质分离的方法，称为β分段盐析。

2.盐析的操作步骤

（1）加入盐或盐的饱和溶液到适当的饱和度 为了避免局部盐浓度过高导致酶的变性，必须边搅拌边缓慢加入，因此这一步骤需要较长的时间。

（2）沉淀与母液分离 为使以后的纯化具有较好的重现性，盐析后沉淀中夹带的母液应尽量除尽。常用的方法包括离心或压滤，这一步操作也要在低温下进行。盐浓度较低时，离心比较容易，而过滤较难；浓度较高时，需要高速离心，但过滤较易。盐析如果在碱性条件下进行，而盐浓度又很高时，盐析沉淀物常常不易离心沉降，有时还可能出现上浮现象。

（3）沉淀再溶解 将盐析获得的沉淀溶于适当的缓冲液中，并除去不溶蛋白，这样相当于又一次纯化。有时也可用不同盐浓度的溶液对沉淀进行分级溶解。

为了使盐析操作达到较好的纯化效果和比较高的回收率，需要进行预备实验以确定合适的饱和度。即加入盐到不同的饱和度，测定各个饱和度下，上清液和沉淀中的总酶活力，找出目标蛋白开始大量沉降对应的饱和度和沉淀基本完全对应的饱和度，这个区间越窄，纯化效果越好，但回收率越低；反之，这个区间范围越宽，回收率越高，但纯化效果较差。所以应根据这两个指标综合考虑确定适当的沉淀区间。

3.盐析效果的影响因素。

（1）pH首先应保证酶液所处pH不会导致酶的变性，必要时可以在缓冲液中进行盐析操作，另外某些盐的加入可能导致pH的改变，如强酸弱碱盐硫酸铵可以使pH下降。同时，控制盐析pH可用于提高纯化效果，大多数情况下，盐析的pH宜接近目标酶的等电点，因为酶蛋白在其等电点附近溶解度小。有些情况下，酶和杂蛋白能形成某种结合，从而干扰盐析分离。此时如控制pH＜5或pH＞6，使它们带相同电荷，可以减少络合物的形成，这样盐析效果常会有些改善，但应注意在这种条件下酶的稳定性与盐的溶解度。

（2）蛋白质浓度 蛋白质浓度能影响盐析效果的重现性，因为蛋白质浓度不同，分级分离范围也往往会发生一些变动，即影响盐析界限。蛋白质浓度高，盐析界限宽，低浓度的盐便可以使蛋白质沉淀，浓度太高时应该通过稀释调节盐析浓度界限，否则目标酶会与其他蛋白质发生共沉淀作用。而另一方面，蛋白质浓度太低，在100μg/mL以下，盐析沉淀一般很困难，有时甚至根本不能形成沉淀。在200μg/mL～1mg/mL范围内，沉淀虽能生成，但时间较长，而且回收率往往不高。为了获得较好的盐析效果，蛋白质浓度应控制在25mg/mL～30mg/mL比较合适。

（3）盐 一般地说，K_SO越大，效果越好。实践表明，就阳离子而言，一价盐通常比二价盐有效；而阴离子则相反，二价盐比一价盐好。符合这种条件的盐有硫酸铵、硫酸钠等。其中硫酸铵最常用，它的最大优点是：溶解度高（25℃时达4.1mol/L）；溶解的温度系数小（0℃为706g/L；25℃为767g/L），即使是在低温的溶解度范围内，几乎所有蛋白质都能盐析出来；价格便宜；浓度高时也不易引起酶蛋白活性的丧失。

用硫酸铵进行盐析时，溶液的盐浓度通常以饱和度表示，即以饱和溶液中盐的浓度为100%。调整溶液的盐浓度有两种方式，即以固体粉末或饱和溶液的形式加入。

当蛋白质溶液体积不太大，而要达到的盐浓度又不太高时，为防止加盐过程中局部浓度过高，最好添加饱和硫酸铵溶液。浓的硫酸铵溶液的pH通常是4.5～5.5，调节pH可用硫酸或氨水。测定溶液的pH时，一般应先稀释10倍左右，然后再用pH试纸或pH计测定。

当蛋白质溶液体积很大，而要达到的盐浓度又很高时，则以加固体硫酸铵为宜，加入量可通过计算，也可以直接查表。加固体较为经济，也较方便，但所用的固体在使用前应经过反复的研细和烘干，并在不断搅拌下缓缓加入，以避免局部浓度过高，同时要防止泡沫的大量生成。

（4）温度 就酶的稳定性和溶解度而言，盐析温度以控制在4℃为宜。因为低温下有利于保持酶蛋白活性，也可以降低其溶解度，更易盐析沉淀出来。(www.daowen.com)

盐析法的优点：简便、安全（大多数蛋白质在高浓度盐溶液中相当稳定）、重现性好，适用范围广泛，同时能够达到浓缩蛋白质的目的。

盐析法的缺点：分辨率差，纯度倍数低，同时还常常有脱盐问题，影响后续操作。

（二）有机溶剂沉淀法

1.原理

同盐析法原理相似，不同蛋白质需要加入不同量的有机溶剂才能使它们分别从溶液中沉淀析出。有机溶剂在这个过程中的主要作用是降低溶液的介电常数，因为分子间的静电引力和溶剂的介电常数成反比，加入有机溶剂，蛋白质分子间的引力增加，从而导致溶解度降低。有机溶剂的另一作用可能是部分地引起蛋白质脱水而沉淀。有机溶剂沉淀法的优点：分辨率高，溶剂容易除去。缺点：酶蛋白在有机溶剂中一般不稳定，易引起变性失效。

有机溶剂沉淀法的操作与盐析法基本相同。

2.有机溶剂沉淀法的影响因素

（1）有机溶剂 选择有机溶剂时的原则是有机溶剂必须能与水完全混合，不与蛋白质发生反应，要有较好的沉淀效应，溶剂蒸气无毒且不易燃烧。用于蛋白质沉淀的有机溶剂中，丙酮的分离效果最好，引起的失活情况也较少，所以最为常用。

（2）温度 因为大多数蛋白质遇到有机溶剂很不稳定，特别是温度较高（例如室温）的情况下，蛋白质极易变性失效，故操作应在0℃以下进行。有机溶剂也必须预先冷却到-20～15℃并在搅拌下缓慢加入。沉淀析出后应尽快地在低温下分离，获得的沉淀还应立即用冷的缓冲液溶解，以降低有机溶剂的浓度。

（3）pH由于蛋白质处于等电点时溶解度最低，故有机溶剂沉淀也多选在靠近目标酶的等电点的pH条件下进行。

（4）离子和离子强度 中性盐在多数情况下能增大蛋白质的溶解度，并能减少变性影响。在有机溶剂分级沉淀时，如果适当地添加某些中性盐，往往有助于提高分离效果。但盐的浓度一般不宜超过0.05mol/L，否则会使蛋白质过度析出，不利于沉淀分级，甚至没有沉淀。

（5）蛋白质浓度 蛋白质本身是多价离子，因此对溶液介电常数有相当的贡献。当蛋白浓度太低时，如过度添加有机溶剂会造成蛋白质变性，这时加入介电常数大的物质（如甘氨酸）可避免蛋白质的变性。蛋白质浓度过高时，溶液介电常数也相应提高，造成共沉现象而影响分离效果。所以，合适的蛋白质浓度也是必须加以考虑的。

（三）液—液分离法

上面介绍的方法是利用溶解度差别进行的，从广义上说，它们都是以分配系数的不同为基础的纯化方法，属于“固—液”类型。与此相对应的，近年来也开发了“液—液”类型的分离法，这种方法又称为双相水溶液分离法（aqueous twophase separation，ATPS）或双水相萃取法。它实际就是利用酶和杂蛋白在互不混溶的两液相系统中分配系数的不同而达到纯化的方法（图5-3）。

图5-3 双水相系统纯化酶过程示意图

原理：将两种不同水溶性聚合物的水溶液混合时，当聚合物达到一定浓度时，体系自然分成互不相溶的两相从而构成双水相体系。双水相体系的形成是由于聚合物的空间位阻作用，相互间无法渗透，而具有强烈的相分离倾向。近年来发现很多聚合物和盐[如聚乙二醇（PEG）/葡聚糖体系和PEG/磷酸盐体系]也能形成双水相。当生物分子进入双水相体系后，由于其表面性质、电荷作用以及各种次级键作用力的存在，使其在上下相之间按其分配系数进行选择性分配。在很大浓度范围内，要分离物质的分配系数与浓度无关，只与其本身的性质和双水相体系的性质有关。

该技术是近年来涌现出来的具有工业开发潜力的各种新型分离技术之一，特别适用于直接从含有菌体等杂质的酶液中提取纯化目标酶，它的主要优点如下所述。

（1）所形成的两相中均含有70%以上的水，这样的环境对于蛋白质来讲比较温和，而且处理量可大可小。聚乙二醇（PEG）和葡聚糖这类物质可作为蛋白质的稳定剂，即使在常温下操作酶活力损失也很少，所以多在常温下操作。

（2）设备简单 仅需一个使粗提液与两项系统充分混合及放置的储罐和一个离心力不高的普通离心机或能使两相快速分离的分离器。

（3）操作方便、快速 回收率一般可达80%～90%，而且使菌体、细胞碎片、多糖、脂等与蛋白质迅速分离。

（四）共沉淀法

除了盐和有机溶剂能沉淀蛋白质外，离子型表面活性剂如十二烷基磺酸钠（SDS）或水溶性高聚物等也可以沉淀蛋白质。共沉淀法就是通过加入这些高分子物质而使蛋白质分级沉淀以达到纯化目的。

非离子型聚合物如聚乙二醇（PEG），当其分子质量大于4000Da时能够非常有效地沉淀蛋白质，与蛋白质共同沉淀下来的PEG通过过滤和透析均不能除去，但它的存在对蛋白质无害，并且不影响盐析、离子交换、凝胶过滤等后续操作。

聚丙烯酸可用来沉淀带正电的蛋白质，因为聚丙烯酸上带有大量的羧基，碱性蛋白带有碱性基团，二者结合形成很大颗粒沉淀下来。加入钙离子后，聚丙烯酸形成钙盐，使蛋白质游离出来，从而使蛋白质纯化。

（五）等电点沉淀

蛋白质处于等电点时，本身净电荷量为零，分子之间的引力最大，而在其他状态下，由于带相同电荷而表现出互相排斥的作用。蛋白质的溶解度随分子间引力增大而变小，因而当其他条件相同时，处于等电点时最容易析出（图5-4）。

图5-4 等电点沉淀法作用机制示意图

由于蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度，沉淀往往不完全，故一般很少单独使用，更多的是作为其他沉淀法的一个组合条件。

但当所需pH与提取缓冲液的pH相差甚远时，等电点沉淀是很成功的。例如，碱性蛋白质可在酸性条件下溶解并在高pH条件下沉淀，而酸性蛋白质可在碱性条件下溶解并在低pH条件下沉淀。具有中性等电点的蛋白质在中性pH附近溶解，这时可用等渗的或略微高渗的缓冲液，有可能仅仅通过把缓冲液稀释到较低的离子强度就能沉淀这种蛋白质。但是有时候不可能用中性等电点来沉淀蛋白质。

（六）反胶团萃取

向水中加入表面活性剂，水溶液的表面张力随表面活性剂浓度的增大而下降。当表面活性剂浓度达到一定值后，将发生表面活性剂分子的缔合，形成水溶性胶团。反胶团萃取研究始于20世纪70年代末期，历史还不长，技术尚不够成熟，但在一些研究工作中已经得到了很好的应用。

如图5-5所示，在有机相内形成分散的亲水微环境，使生物分子在有机相（萃取相）内存在于反胶团的亲水微环境中，消除了蛋白质难溶于有机相或在有机相中发生不可逆变性的现象。通过控制pH、离子强度、有机溶剂的种类以及表面活性剂的种类和浓度等条件，可以改变蛋白质在两相中的分配系数。不同蛋白质表面电荷与相对尺寸的不同，使得它们在两相中的分配系数不同，从而达到分离的目的。

图5-5 反胶团的形成示意图