抽提得到的提取液中目标酶的浓度往往很低,要得到一定数量的酶,需要处理的抽提液体积比较大,不便操作。通过浓缩(concentration)可以提高浓度,缩小体积,一方面可使每一步的回收率提高,同时酶蛋白质在浓缩溶液中的稳定性也较高。常用的浓缩方法有以下几种。
1.蒸发
一般真空蒸发浓缩除了效率低、费时外,有时还要加热,并且可能产生泡沫,易使酶蛋白质变性失效,因此,不能用于稳定性较差的酶。同时蒸发过程还可能出现增色现象,影响产品的质量。过去实验室中也采用蒸发浓缩,即让暖空气流通过冷的酶液表面,或让暖空气流通过装有酶液的透析袋使其加速蒸发,但此法效率不高。
工业生产上现在应用较多的是薄膜蒸发浓缩,即将待浓缩的酶溶液在高真空度下变成极薄的液膜,并使之与大面积热空气接触,让其中的水分瞬时蒸发而达到浓缩的目的。薄膜蒸发浓缩器有三种形式:升膜、降膜和刮板。
2.超滤
超滤(ultrafiltration)是浓缩蛋白的一种重要方法。在加压情况下,将待浓缩液通过一层只容许水分子和小分子选择性透过的微孔超滤膜,而将酶等大分子滞留,从而达到浓缩目的。这种装置中膜的空隙易被大分子堵住而影响流速,所以超滤器常附有搅拌装置。近年来国外已经生产各种型号的超滤膜,可以用来浓缩不同相对分子质量的蛋白质。
这种方法的优点是:无热破坏;无相变化;保持原来的离子强度和pH;如果膜选择适当,浓缩过程还可能同时进行粗分,成本也不高,故较为常用。超滤可用于少量样品,也可用于工业生产规模,现已有各种超滤装置可供选择。详见本章第三节。
3.凝胶过滤
凝胶过滤(gel filtration)是利用葡聚糖凝胶Sephadex G-25或G-50等能吸水膨润,而酶等大分子被排阻在胶外的原理进行的一种浓缩。通常采用“静态”方式应用这种方法,可将干胶直接加入样品溶液,胶吸水膨润一定时间后,再借助过滤或离心分出浓缩的酶溶液。此方法的优点是条件温和,操作简便,也没有pH与离子强度等的改变,但缺点是可能导致蛋白质回收率降低。(www.daowen.com)
4.沉淀法
用盐析法或有机溶剂将蛋白质沉淀,再将沉淀溶解在小体积的样品溶液中。这种方法往往造成酶蛋白的损失,同时应避免酶的变性失效,优点是浓缩的倍数可以很大。同时因为各种蛋白质沉淀范围不同,也能达到初步纯化的目的。
5.吸附法
将蛋白质吸附到离子交换剂上,然后用少量盐溶液洗脱下来。这种方法将在本章第三节中详细讲述。
6.渗透浓缩法
将蛋白质溶液放入透析袋中,然后在密闭容器中缓慢减压,水及无机盐流向膜外,蛋白质即被浓缩;也可将聚乙二醇(PEG)涂于装有蛋白质的透析袋上,置于4℃下,干粉PEG吸收水分和盐类,大分子溶液即被浓缩,此方法快速有效,但一般只能用于小量样品,而且成本很高。
7.反复冻融(freeze-thawing)
反复冻融的原理是溶液相对纯水,会发生熔点升高、冰点降低的现象。可采用两种方式进行:一是先将溶液冻成冰块,然后使之缓缓融解,这样,几乎不含蛋白质和酶的冰块就将浮于液面上,而酶等则融解并集中于下层溶液(至原体积的四分之一左右)。另一种则是先让酶溶液缓缓冻凝,然后再移去形成的冰块。冻融浓缩的主要问题是,浓缩过程可能会发生离子强度与pH的变化,从而导致酶失效,其次是需要大功率的制冷设备。
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