在开始纯化以前，要始终记住以下两点：
第一，纯化策略是一个系统化的途径和方法。整个策略要考虑的因素很多，包括纯化过程中的应用条件、限制因素以及产物的最终用途等，最终要实现高效、经济的纯化。第二，尽量缩减纯化的步骤——越简单越好！一般而言，步骤越多，最终产品回收率越低。图5-1所示为产品纯化过程中需要考虑的几种主要因素，包括纯度、回收率、容量以及纯化速度（步骤）等，通常几种因素不可能同时兼顾，因此依据纯化的目标需要有所权衡和取舍。
图5-1 回收率与步骤的关系
1.设定目标
在纯化酶蛋白的过程中，要想高效、经济地获得纯品，首要一点便是设定目标，包括设定纯度要求、蛋白量、生物活性保留度以及可支配的时间与金钱。纯度的要求必须考虑到原料的性质、终产物的预期用途和特殊的安全性问题。其他因素同样会影响目标的优先顺序。例如，高收得率通常被定为最主要的目标，但如果产量只要求很少，它就显得不那么必要了。下面将阐述设定目标的具体内容。
（1）根据产物的最终用途设定其纯度要求，见表5-1。
表5-1 纯度要求的设定
（2）确认最关键的杂质。
（3）尽早确认可能残留的杂质的性质。
（4）超过纯度要求比低于纯度要求好。虽然纯化的步骤越少越好，但必须保证终产物的质量。如果产物未达到纯度要求且混有未知性质的杂质，则后续的实验结果都是不可靠的。
（5）应尽早除去可引起目标蛋白降解、失活或干扰分析的杂质。在每个纯化步骤中都应考虑维持酶蛋白的生物活性。第一步就应当除去蛋白酶并把目标蛋白转移至一个更“友好”的环境中。
（6）在一定经济条件下，酶蛋白分离纯化应达到规定的纯度并得到安全可靠的产品。经济是一个复杂的问题。在商业生产中，诸如收得率、生产力及速度等因素都必须服从于“市场经济”这个指挥棒，当然可信度也很重要。
（7）如果产品将应用于生物制药方面，纯化过程要考虑特殊的安全性要求，例如检测或除去传染因子、产生免疫性的污染物、产生肿瘤的危害物等。
2.明确目标蛋白与主要杂质的性质
检查在什么条件下目标蛋白比较稳定——至少检测pH和离子强度两个条件。(www.daowen.com)
所有关于目标蛋白及关键杂质性质的信息都有助于指导在纯化过程中选择分离技术和操作条件。目标蛋白的相关信息包括分子大小、等电点、溶解度等。活性单向和双向电泳可以用于指示样品成分、目标蛋白与主要杂质的性质。充分认识目标蛋白的“稳定平台”可有效避免蛋白质失活变性。建议至少检测一下适合的pH和离子强度。表5-2所示为目标蛋白的不同性质是如何影响选择纯化策略的。
表5-2 蛋白性质及其对纯化策略的影响
3.建立分析的方法——选择快速、有效的检测方法
要了解每个纯化步骤的效率，应该建立以下分析通道：①一个快速、可靠的分析目标蛋白的方法；②蛋白纯度的检测方法，这将在下面谈到的“纯度的检定”详细论述；③总蛋白量的检测方法，主要有Lowry法和Bradford法（更适合于含脂质多的蛋白）；④对必须清除杂质的分析方法。
4.尽量减少对样品的处理操作步骤
纯化过程中不宜重复相同的步骤和条件，否则只能使酶的总活力下降而并不能进一步提高酶的纯度。
5.尽量减少添加剂的使用
只在从本质上可以稳定目标酶或改善提取分离效果时才使用添加剂；只选用容易去除的添加剂。
6.尽早去除有破坏性的杂质
在实验室通常使用SephadexTMG-25凝胶过滤以达到简单的净化。适用于相对分子质量＞5000的蛋白，这个步骤的作用是使蛋白质脱盐、更换新的缓冲体系、去除相对分子质量小的蛋白质等。目前比较常用的预装柱主要有GE Pharmacia公司的HiPrepTMDesalting 26/10、HiTrap Desalting、Fast Desalting PC 3.2/10和PD-10 Desalting等。
7.其他
尽早采用高效分离方法，将最昂贵、最费时的分离方法放在最后阶段，也就是说，通常先运用非特异、低分辨的操作方法，如沉淀、超滤和吸附等。这一阶段的主要目的是尽快缩小样品体积，提高产物浓度，去除最主要的杂质（包括非蛋白质类杂质）。随后是高分辨的纯化方法，如具有高选择性的离子交换色谱和亲和层析，而将凝胶过滤层析这类分离规模小、分离速度慢的操作单元放在最后，这样可提高分离效率。
不同的纯化方法有各自的特点和作用，这就决定了它们适用于纯化过程的不同阶段。例如，选择性热变性因能以很小代价除去大量的杂蛋白，而且不需要引入其他物质，也不增加液体的体积，所以可以放在最先进行。吸附法操作简便和迅速，且可以处理的样品量较大，吸附前不一定要求脱盐，因此也可考虑安排在前面的步骤进行，但吸附后常要用盐溶液洗脱。接着用盐析法似乎是有利的。盐析的回收率一般比较高，又能同时达到浓缩样品的目的，但分辨率不高，所以可以放在比较靠前的位置，但大液量的脱盐比较麻烦。结晶虽然可以达到一定的纯化目的，但它要求酶液达到相当的纯度和浓度，所以应放在较后的环节。有机溶剂沉淀要求低温快速处理，如果酶液体积大，这种方法往往受设备容量的限制，故不宜放在前面的步骤里。但另一方面，随着酶纯度的提高，酶的稳定性也跟着降低，此时再用有机溶剂处理，即使目标酶不变性，也会导致回收率下降。其他如凝胶过滤法、聚集层析法以及亲和分离法等，虽然分辨率很高，但应用于大体积操作目前还存在一些问题，因此常放在稍后的步骤进行。
总之，进行酶的纯化工作之前，不仅要了解目标酶的物理和化学性质，还要对各种纯化分离方法的优缺点以及对样品的要求等有所了解，才能做到心中有数。同时要注意前后步骤的衔接，考虑前一步骤对后面操作的影响，才能机动灵活地加以应用，使纯化工作高效、有效地进行。
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