体外基因重组（gene recombination in vitro），简称DNA重组技术（recombinatant DNA technique）或基因工程（gene engineering）。它是外源基因与载体DNA通过酶学方法在体外进行重组，然后将形成的重组子转化到受体细胞中，使所需要的外源基因在受体细胞中得到复制表达，从而达到改造生物遗传特性目的的一种技术与方法。与基因突变相比，它具有更大的预见性和主动性，而且也不像体内基因重组那样易受种间不相容性的限制，可在远源的DNA分子间进行杂交，并能选择适宜的载体和受体系统，合理的重组设计，高效表达目标基因，因此人们特别重视这种技术。应用这种技术时应考虑以下问题。

1.目标基因

目标基因获得方法主要有：基因片段物理分离法、DNA片段单链化酶切除法、目标基因片段亲和保护酶切法、DNA片段转化分离法、mRNA亲和分离法、mRNA反向转录法和DNA片段化学合成法等。其中前三种方法仅限于特殊情况应用，第四种也被称为鸟枪（shot gun）法，它和第五种方法具有较大的普遍适用性。不过，为使真核基因能在原核细胞中表达，一般认为最好采用mRNA反向转录法，此法如果与特殊的载体质粒结合，将cDNA直接掺入到载体中，则更为有效。但是，近年来随着人工合成DNA技术的进步，人们更倾向于选择DNA片段化学合成法，因为反向转录法也有一些缺点：①要获得十分纯净的mRNA很难；②合成cDNA往往缺少5′-末端；③反转录过程常可能出现随机终止；④有时还需要外加某些接头序列（linker）。人工合成法则可以根据受体细胞转录、翻译系统的特点，选择最佳的密码子，合成人们所需要的任何序列，包括重组需要的接头序列在内的全序列。

2.载体

载体可将异源基因引入受体细胞，并使之能在其中进行复制和表达。载体应符合下述要求：对一种限制性内切核酸酶只有少数（1～2个）切点；带有特殊标记，能指示重组子的转入；在重组后，即连接了异源DNA后，不失去扩增能力；拷贝数目多（即“松弛型”）；容易分离；安全；最好是高效表达载体。常用载体有质粒和噬菌体。

3.工具酶

在基因工程中最常用的工具酶是限制性内切核酸酶、脱氧核苷酸末端转移酶、反转录酶、核酸酶S1和DNA连接酶等。

限制性内切核酸酶是一类能识别特定核苷酸序列、并能专一地切断双链DNA的内切核酸酶。根据其专一性（专一识别序列和酶切点）及对辅助因子的要求特点可分为三类：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。用于基因工程的是Ⅱ型限制性内切核酸酶，它们能识别4～6个核苷酸组成的回文结构序列，或通过“错切”方式产生黏性末端（sticky或cohesive end）的DNA片段，或通过“平切”的方式形成平头末端的DNA片断。

脱氧核苷酸末端转移酶催化脱氧核苷酸连接到DNA的3′-OH末端，在基因工程中用以形成人工黏性末端。当以Co²⁺作为辅助因子时，该酶不仅能催化脱氧核苷酸转移到3′-OH的末端，对平头的DNA和5′-端突出的DNA也能发挥作用。

DNA连接酶催化DNA的3′-OH与5′-磷酸端形成磷酸二酯键，是DNA重组工作中不可缺少的关键酶。通常应用T4DNA连接酶，因为它既能催化黏性末端连接，又能催化平头末端连接，同时只要求ATP作为辅助因子。

4.基因重组

这是关键的一环，包括直接黏结法和加尾黏结法。前者简便，但易产生自身连接，无效重组率较高，特别是外源DNA片段大于18kbp（碱基对）时更是如此。后者无效组合率低，但要用到多种工具酶。为了提高直接黏结法的有效重组率，可以采用在识别和作用的核苷酸序列专一性上有部分共同要求的两种限制性内切核苷酸酶。

5.重组子转化

进行重组子转化时，首先要选择适宜的受体细胞，这种细胞具有以下特点：能接受外源DNA；在标记上与载体相对应；有利于表达；安全。

最常用的受体细胞是大肠杆菌，它的优点是遗传背景清楚，有成套的载体、受体系统可供各种基因进行稳定、高效的克隆、表达。缺点是该菌属于革兰阴性菌，表达产物除少数能分泌到培养介质和细胞周质外，通常都积累于胞质内，有时还可能形成无活力的不溶性包涵体（inclusion body），给产物的分离纯化带来困难。

其次是枯草芽孢杆菌，它们已被广泛用于许多工业酶的生产，优点是它们属非病原性的土壤微生物，没有热原物质等问题，表达产物可直接分泌到培养介质中。但是其遗传背景不如大肠杆菌清楚，而且往往包含大量蛋白水解酶，常导致表达产物的降解。近年来，也通过改造获得了一些蛋白酶缺陷型菌株。

第三是酵母，它的优点是无热源物质等的污染，也可构建成分泌型受体菌株，而且能进行翻译后加工，如糖苷化等，适于真核基因的表达，但是表达水平一般较低（其中毕赤酵母目前的表达水平较高）。(www.daowen.com)

除此之外，近年来人们的注意力也开始转向动植物细胞，因为它们能有效地进行翻译后加工，以天然构象形式将表达产物分泌出来，同时不会产生微生物表达后可能带来的各种问题，但不易培养，产量较低，成本高。

此外，要选取易被感受的生理状态，并增加适宜的处理以提高转化效率。对大肠杆菌、假单孢杆菌来说，常用CaCl₂处理法，这种情况下1μg的DNA一般可获得10⁷个左右的转化子。对于枯草芽孢杆菌来说，由于其转化率普遍较低，并且转化率随单体占有的百分比不同而不同，同时开环的和线性的DNA都不具有转化能力，因此仅选取感受态往往不够，一般先用溶菌酶处理使之变为原生质，然后再在聚乙二醇存在条件下进行转化。

6.基因表达及相关问题

重组子进入受体细胞后，先通过DDDP、DDRP进行复制和转录，形成mRNA，然后mRNA在核糖体上进行翻译，合成蛋白质，完成基因克隆和表达的过程。但是，要使引入的基因得到高效表达，在构建重组子时必须考虑以下几个问题。

（1）外源基因高效表达 为使外源基因得到高效表达，首先应在适当的位置上放置一个强的启动基因（启动子），即一个能被受体细胞DDRP转录识别的起始信号序列。其次，还应在mRNA的起始密码子上游端3～12个碱基处放置一个能被受体细胞核糖体识别的SD序列（shine-dalgarno sequence，原核生物中mRNA 5′-端含有的一段特殊的核苷酸序列），该序列由3～9个碱基组成，能与30S亚基形成络合物，引发蛋白质合成。各种受体细胞要求的启动子与SD序列可能不同。如图4-8显示了如何调整外源SD序列间的距离，从而达到能在大肠杆菌中高效表达的一般方法。其中，关键的一步是借助一种外切核酸酶进行修剪，以便在两者间形成一个不同核苷酸长度的混合体系。

（2）选择适宜的表达方式 外源基因可采用两种方式表达。一种是以“天然蛋白”（native protein）形式直接表达，即将目标基因直接连接于适宜的启动子与SD序列后进行表达，表达产物无需后续加工就是天然蛋白。但是在构建重组子时，起始密码子AUG前端必须有一适宜的序列能被限制性内切核酸酶作用，并需保证AUG和启动子与SD序列间有适宜的距离。

图4-8 调整启动子、SD与外源基因起始密码子间的距离

另一种是以“融合蛋白”（fusion protein）的形式表达，即将目标基因连接于受体细胞（或载体）的某基因下游，或该基因N-端部分序列的下游，然后借助该基因的表达带动目标基因的表达，因而得到的表达产物是一融合蛋白，即在目标蛋白的N-端前面还附有别的蛋白质或肽段。这种表达方式的优点是：目标基因处于受体或载体基因调节系统的控制之下，表达效率较高，产物较稳定，表达产物是分泌型；同时外加的肽段还可作为“标签”（tag）用于进行产物的亲和纯化。采用融合基因表达方式的一个重要问题就是如何将目标蛋白从表达产物中分离出来。一般地说，如果目标蛋白内部不含有甲硫氨酸（Met），那么，可以采用溴化氰（CNBr）化学断裂法；否则就必须在目标基因前插入一段适当的接头，以便在表达后借助位点专一的或序列专一的肽酶从接头处切出目标蛋白。

（3）保持载体的稳定性 载体，特别是重组质粒，常易出现载体（基因）丢失现象。有两种情况：一种是质粒在细胞分裂过程中产生了不等分配，称为“分离不稳定性”。这种情况可采用抗生素选择压力法解决，也就是在培养基中添加载体“标记”抗生素，使质粒丢失的菌体无法生存。另一种是基因结构发生了改变，即“结构不稳定性”。这种情况较复杂，据报道可通过控制培养条件调整菌体的生长速度加以解决。

（4）表达产物的分泌 基因表达产物合成后，或停留于细胞质中，或结合于质膜，组成胞内酶；或穿过质膜外输到细胞周质或培养介质中成为胞外酶，这就是所谓的“分泌”（secretion）。革兰阳性菌（如金黄色葡萄球菌）和阴性菌（如大肠杆菌）不同，后者细胞外有一层细胞壁屏障，分泌蛋白一般止于周质，不能进入培养介质，成为“周质酶”或“周质蛋白”；而前者则由于没有细胞壁的阻碍，表达产物可直接进入培养介质，称为“外泌”（excretion）。从生产角度考虑，外泌显然最为有利，这也是人们倾向于采用芽孢杆菌等作为生产菌的原因之一。要使表达产物能够分泌，通常应该在产物的N-末端添加一段由10个左右亲水氨基酸和相继20～30个疏水氨基酸组成的信号肽。

为了获得外泌蛋白，有三种办法可供考虑：一是突变，即通过突变筛选出影响细胞壁结构的抗生素，如环丝氨酸、新生霉素、氨苄和多烯等具有抗性的突变株，这些菌株一般是超产、高分泌型的；但是应注意其中许多外膜“渗漏型”（leaky）的突变株，其物理性能往往太弱。二是与外膜蛋白如OmpF做成融合蛋白。三是引入能诱发大肠杆菌细胞壁通透性增大的kil基因。

值得一提的是，分泌实际上是蛋白质合成后的一种定域运转方式；DNA重组技术既可赋予表达产物以分泌性质，同时也是研究运转机制的有效手段。

（5）保证异体蛋白在受体细胞内的稳定性 现在已知在大肠杆菌内至少有八种以上的蛋白酶可以分解酪蛋白、胰岛素等异体蛋白，外源基因表达产物作为异体蛋白也同样面临这一问题。解决的办法有三种：一是选择蛋白酶基因缺失的变异株作为受体细胞；二是同时克隆蛋白酶的抑制剂基因；三是促进基因表达产物的加速分泌。

7.体外基因重组在酶生产中的应用

体外基因重组在酶生产中可以发挥以下几个方面的作用：①提高微生物中原有酶的产量；②用微生物表达、生产动物或植物的酶基因；③构建“多酶复合体”或“多酶系统”；④通过移除、添加或置换基因中的某些碱基，克隆表达进行酶分子改造。