理论教育 微生物酶的生产与食品酶学原理

微生物酶的生产与食品酶学原理

时间:2023-11-18 理论教育 版权反馈
【摘要】:酶主要通过两条途径获得,一是化学合成,包括酶的化学全合成、酶类似物和模拟酶的化学合成;二是生物合成,即从生物中提制。通过对产酶菌种的选育,可以使参与微生物分解代谢的酶的活力水平提高几千倍,参与合成代谢的酶的活力提高几百倍。基于以上优点,利用微生物生产酶制剂大大降低了酶的生产成本,提高了酶制剂的应用潜力,从而推动了工业化酶制剂的生产和发展。

微生物酶的生产与食品酶学原理

酶主要通过两条途径获得,一是化学合成,包括酶的化学全合成、酶类似物和模拟酶的化学合成;二是生物合成,即从生物中提制。继1964年我国率先从氨基酸出发合成具有生物活性的胰岛素之后,1969年又有学者通过化学方法人工合成了有活性的核糖核酸酶,而且发展了一整套固相合成肽的自动化技术。但是,从经济和技术等角度考虑,用化学方法来合成酶离实际生产还比较遥远。因此,直接利用生物合成酶是现今最主要的办法。

在酶制剂工业发展早期,酶多从动植物原料中提取,是最早采用并且一直沿用至今的一种方法。采用各种提取技术,直接从动植物的细胞或组织中提取酶。提取方法虽简单易行,但必须要有充足的原材料,这就使酶的广泛应用受到了限制。但是,在动植物资源丰富的地区,提取法仍然具有应用价值。例如,在屠宰厂,可从家畜胰脏中提取胰酶;在水果加工厂,可从菠萝皮中提取菠萝蛋白酶。

动植物原料一般生长周期长,同时还受地理、气候和季节等各种因素的限制,不适于大规模工业化生产。所以,近年来转向采用微生物发酵制取酶,其优点如下所述。

(1)种类繁多。动植物体内所有的酶几乎都能从微生物中找到,并且微生物的筛选方法简单、成熟,有可能在短时间内根据应用特点和要求从成千个菌株中筛选出最佳的产酶菌株。

(2)繁殖快,发酵周期短,培养基价格低廉,能通过控制培养条件大幅度提高酶的产量,酶制剂可以实现大规模、低成本的工业化生产。

(3)微生物具有较强的适应能力,可以通过改变微生物的遗传性质,培育出新的、更理想的菌株,从而大大提高产酶水平。通过对产酶菌种的选育,可以使参与微生物分解代谢的酶的活力水平提高几千倍,参与合成代谢的酶的活力提高几百倍。

(4)同样的反应可以用来源于不同微生物的性质相近的酶催化,因此可灵活选择生物反应器,以便与前后工序相配合。

基于以上优点,利用微生物生产酶制剂大大降低了酶的生产成本,提高了酶制剂的应用潜力,从而推动了工业化酶制剂的生产和发展。

(一)产酶菌的获取

1.工业上对产酶菌的要求

(1)为非致病菌,在系统发生上与病原体无关,也不产生毒素。这一点对食品和医药用酶尤为重要。

(2)菌种的遗传性能稳定,不易变异退化、不易感染噬菌体。

(3)除蛋白酶生产菌种外,其他产酶菌种的产蛋白酶活力应该很低,防止目标酶的水解

(4)目标酶的产量要高,酶的性能符合应用需要,而且酶的提取简便,最好是产胞外酶的菌株。

(5)能利用廉价原料,发酵周期短,容易培养。

产酶菌一般都要通过筛选得到,筛选环节包括:菌样采集、菌种分离、纯化和生产性能鉴定。

2.产酶菌的分布规律

(1)相近菌种产生的酶在性质上一般相近或相似。例如,地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)和淀粉液化芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)是近缘菌,它们产生的蛋白酶性质也相似;反之,不相关的菌种,所产的酶或酶系则往往不同。

(2)胞外酶的稳定性和最适反应条件通常和菌种产酶的最适生长条件一致。例如,嗜碱枯草芽孢杆菌蛋白酶作用的最适pH就比嗜中性地衣芽孢杆菌蛋白酶高出几个单位。同样,从嗜热凝结芽孢杆菌(B.coagulans)得到的α-淀粉酶与常温淀粉液化芽孢杆菌α-淀粉酶相比,其作用的温度范围就高10℃左右。但是胞内酶的热稳定性常比该菌的最适生长温度要稍低一些,这可能是因为细胞内环境对酶有保护作用。

(3)为获得能够降解某种物质的产酶菌株,一般可从该物质比较丰富的地方寻找。例如,豆科植物根系土样中,往往存在根瘤菌;油田和炼油厂周围土层中常见分解石油的微生物;分解尿酸的产酶菌株可从鸡棚、鸡粪堆中分离;而要降解某些合成物质的产酶菌则往往能在污水处理处得到。

采集菌样后,通常还要进行一些“富集”预处理,例如,在较高温度培养一定时间,或使用高选择性生长培养基培养一定时间,以提高目标菌种的数量,然后再进行菌种的分离、纯化。产酶菌可采用常规的平板划线法或直接稀释法分离和纯化。

3.菌种生产性能的检定

生产性能的检定主要通过初筛和复筛确定。初筛是从已分离出来的菌种中挑出能产生目标酶的菌株;复筛是在初筛基础上筛选产酶量高、性能更符合要求的菌株。初筛要求检出方法快捷、简便;复筛则要求测定方法相对准确可靠。

初筛多采用平板培养透明圈法。例如,筛选水解酶的产生菌,以该酶的底物作为平板培养基的主要碳源或氮源。这种情况下,如果某菌株产生所需要的酶,经过一段时间的培养后,就会在该菌落的周围形成一个透明的水解圈(clearing or lysis zone)。例如,用含有木聚糖的平板筛选产木聚糖酶的菌株。从透明圈的大小可大致判断出菌株的产酶能力。但是,根据透明圈来判断并不一定准确,因此,必须进行摇瓶培养,取样测定酶的活力。从产生透明圈的早晚可大致判断该菌株产酶的时间;通过比较不同培养条件下透明圈的大小还可大体了解该菌对培养条件的要求。有时透明圈不明显,可在培养结束时加入底物的沉淀剂,使未分解的底物析出,这样透明圈就能更清晰地衬托出来,如采用刚果红染色法和乙酸铜染色法。另一种办法是以接上色素的“色原底物”(chromogenic substrate)作为平板培养基的主要碳源或氮源,可以直接观察到水解圈的有无及大小。如果是产酶菌,在它生长繁殖时,就会将其周围的色原底物水解,释放出色素或接有色素的单体,形成澄明透亮的光环,更便于被迅速检出。

复筛多采用摇瓶培养的方法进行,即将初筛出来的产酶能力较强的菌株移入三角瓶内振荡培养,然后用常规的测定方法分析检定培养产物,从中找出产酶量最高、性能更符合要求的菌株。因摇瓶条件和发酵罐条件大致接近,所以测得的结果一般能反映产酶菌实际生产能力。

目前已有大量的优良产酶微生物菌株通过以上经典的筛选方法从自然界中被分离得到,如嗜热棉毛菌(产木聚糖酶、脂肪酶等)、嗜热拟青霉(产木聚糖酶、葡聚糖酶等)、米黑根毛霉(产脂肪酶、角质酶、葡聚糖酶等)、嗜热子囊菌(产木聚糖酶、纤维素酶等)、毛壳霉(产甘露聚糖酶、葡聚糖酶等)和巴伦葛茲类芽孢杆菌(产几丁质酶、葡聚糖酶等)等。

(二)产酶菌的培养

1.菌种的保存与制备

微生物的优良性状与菌种的保存方法及保存条件有着直接关系。微生物种子的保藏方法多样,各种方法所适用微生物的种类和效果不一样,在具体应用中各有利弊,不管采用的措施简单还是复杂,原则都是一致的,即选用优良的纯种,最好是休眠体(分生孢子、芽孢等),创造一个使微生物代谢缓慢、生长繁殖受抑制、不易突变的环境。其环境条件的要求是干燥、低温、缺氧以及添加保护剂等。常用的保藏方法有定期移植保藏法、液体石蜡保藏法、沙管土壤保藏法、麸皮保藏法、蒸馏水保藏法、冷冻干燥保藏法及液氮超低温保藏法等,各种方法在微生物学方面的书中均有详细论述,在此不一一介绍。(www.daowen.com)

在制备种子时应注意两点:①防止污染,尽量减少转移的次数,如直接用固体斜面菌种接种种子瓶;②避免对种子培养基进行长时间高热灭菌,以防对种子的生长产生不良影响。

2.培养方法

这里的微生物培养主要指微生物发酵,即让所需要的微生物大量繁殖,进而产生大量的目标代谢产物——酶。按培养基状态可以分为固体发酵法和液体发酵法,如图4-1所示。

(1)固体发酵法 固体发酵又称固态发酵,是指微生物在湿的固体培养基上生长、繁殖、代谢的发酵过程。固体发酵的应用很广,历史悠久,是一项古老的发酵技术。古代的人类将其用于制造干酪、面包发酵、制曲酿酒、堆肥生产等方面,在人类发展文明史上有着重要贡献。

随着近代科学技术的进步和工业生产日益扩大,液体深层发酵技术发展迅猛,在生产规模和产量方面都大大超过固体发酵。液体发酵工艺具有产量大、机械化程度高、易于监控、转化率高的优点,如大型的发酵设备连续化生产培养酵母,在24h内就可以生产数吨蛋白质,蛋白质含量高达40%~80%。一座年产万吨饲料酵母的工厂所生产的蛋白质数量相当于666.6hm2耕地生产的大豆蛋白。但这种工艺存在投资大、能耗高、成本高等缺点,特别是生产中产生的废液污染环境。由于上述限制,以及20世纪70年代以来,世界性能源危机的出现和环保意识的增强,固体发酵这一古老技术又重新受到重视。从污染控制难度方面比较,最初人们认为,固体发酵比液体发酵难,倾向于应用液体发酵。但随着近几年技术发展,固体发酵污染相对较难控制的问题已得到解决,固体发酵污染面积小,污染后损失小,而液体发酵不污染则罢,如污染就是一罐。

近年来,我国利用固体发酵产酶发展的势头良好。虽然在具体操作、规模及深度方面与国外研究相比仍有一定距离。比如,在利用细菌固体发酵降解农业残留废弃物方面,我国研究很少,大部分停留在发酵试验阶段或用于饲料方面。近年来,微生物基因遗传技术的应用、优良菌株的发现和筛选,以及生产工艺方面的改进,也促进了固体发酵技术的发展。

固体发酵湿培养基一般含水量在30%~80%。此培养基通常是“手捏成团,落地成散”,所以此发酵有时也可称为半固体发酵。中国农村的堆肥、青饲料发酵和酒曲生产,都是典型的固体发酵。固体发酵主要适用于霉菌,这是由于霉菌细胞内的渗透压比较高,不会因为固体基质的高渗透压而致死。目前,我国仍有利用固体发酵法生产酶制剂的,最普遍的是酿酒工业的糖化曲、食品工业用果胶酶和饲料工业中的酸性蛋白酶。

图4-1 固体发酵和液体发酵过程流程图

(资料来源:Ashok等,2017,Biocatal Agric Biotechnol)SSF—固体发酵SmF—液体发酵

①固体发酵所用菌种:优良菌种的筛选和培养是固体发酵技术得以应用与突破的关键。除传统的发酵菌株外,菌种的筛选还要符合下列条件:a.繁殖速度快,菌体蛋白质含量高;b.能同化基质碳源和无机氮源;c.无毒性和致病性;d.菌种性能稳定,抗杂菌能力强。通常采用的菌种有米曲霉(A.oryzae)、黑曲霉(A.ruger)、白地霉(Geotrichum candidum)等真菌。此外在生产中采用混菌培养,利用菌群的协同作用提高对底物的利用率,效果良好。在国内,利用菌种多数为霉菌等真菌,只有少数纤维素酶的生产用细菌。在国外,利用嗜热、嗜碱及嗜温性细菌固体发酵生产目标酶的研究大大多于国内,并且在利用其降解农业副产物方面也领先一步。我国在开发优良菌种扩大利用范围方面仍大有作为。

②固体发酵的原料:固体发酵的原料来源十分广泛,利用最多的是谷物糠麸,还有淀粉或糖的农副产品及其渣粕和工业废渣等,如薯渣、玉米渣等淀粉渣可用于酶制剂。而利用秸秆类和蔗渣等农业废弃物则较困难,主要是因为此类原料难以被酶水解。工业废渣是另一类数量庞大的可利用原料,如豆制品豆渣、酒糟、啤酒渣、果品饮料加工的果渣、工业发酵生产的各种废渣等,此类废渣含水量高,含有机质高,处理不及时极易污染环境。如直接干燥则耗能太大,得不偿失;直接作饲料由于不能保存,喂养不当,反而无益。采用固体发酵技术可大量处理此类废渣,能获较好效果。有关这方面的应用,国内外均有成功的经验和商品化生产。此为绿色环保工程,值得大力推广。

③固体发酵的方法:根据固态发酵微生物的特点分为好氧发酵、兼性好氧与厌氧固体发酵。厌氧菌固体发酵生产较简易,一般采用窖池堆积,压紧密封进行。好氧菌的固体发酵生产可以将接种后的培养基摊开铺在容器表面,静置发酵,也可以通气或翻动,使能迅速获得氧和散去发酵产生的热。因通气、翻动、设备条件、发酵菌种和产物等的不同,固体发酵的反应器和培养室也是多种多样。如图4-2所示,为两种常见固体发酵装置示意图。固体发酵方法如下。

图4-2 两种常见固体发酵装置示意图(资料来源:Soccol等,2017, Biotechnol Res Innovation

(1)实验室规模固定床固体发酵生物反应器(2)强制排气混合式固体发酵生物反应器

(1)1—空气泵;2—空气分配系统;3—湿度调节器;4—反应器中,发酵管伸入到能够控温的水浴中;5—过滤器;6—流量传感器;7—控制面板;8—计算机数据采集与控制软件;9—CO2、O2、湿度及温度传感器连桶。(2)1—固体培养基罐;2—空气流量调节阀;3—空气温度探头;4—相对湿度探头,5—排气阀;6—加热盒;7—湿度调节器;8—冷却循环水;9—电阻加热器

浅盘法:将固体培养基平铺在浅盘或竹匾内,进行微生物培养和产酶。固体培养基的堆积厚度为3~5cm,放在能够控制温度的曲房内盘架上进行发酵。该法占用曲室面积大,曲盘数量多,全部依靠手工操作,劳动强度大,卫生条件也差,曲盘洗清、灭菌、维修等耗蒸汽和材料也很多,且产量和质量不稳定,现代工业生产已很少应用。

转桶法:固体培养基接入菌种后,放在可旋转的转桶内,当桶慢慢转动时,培养基即在转桶内翻动,通气及温湿度调节较为均匀,有利于控制微生物生长和产酶的适宜条件。本法的机械化程度较上法稍高,劳动强度也有所减轻,但转桶的清洗灭菌操作较难。

厚层通气法:在浅盘法的生产实践基础上改进而来,将固体培养基经过蒸煮灭菌拌入种曲后,平铺在水泥制的具有多孔假底的大池内,培养基厚度一般在20~30cm。近年来,国外已有高度达数英尺者。培养基铺好后,待微生物已开始生长,曲温逐渐升高时,即从池内假底下面通入一定温度和相对湿度的空气,室内同时保持一定温度和相对湿度进行培养,使微生物能在比较适宜的环境生长繁殖和产酶。

厚层通气法与前两种方法比较,设备利用率大大提高,发酵中途也不必人工经常翻曲,使劳动强度降低,是固体发酵法中较好的一种办法。

国外在霉菌酶的生产中采用固体发酵法的较多,尤其是日本,20世纪60年代全部实现机械化。美国所用的浅盘制曲法,是将加水润湿的麸皮在绞笼中蒸熟后送入密闭培养室中的盘内,通入调温调湿的空气培养制曲。日本则多使用厚层制曲,蒸料与培养于一炉,麸皮拌谷糠加稀酸溶液于曲箱假底,通入自动调温调湿及控制氧气比例的无菌空气。为防污染起见,原料有时还用甲醛β-丙烯内酯灭菌。

在固体发酵中,细菌或酵母附着于固体培养基颗粒的表面生长,而丝状真菌可以穿透固体颗粒基质,进入颗粒深层生长。在固体培养中,微生物是在接近于自然条件的状况下生长的,有可能产生一些通常在液体培养中不产生的酶和其他代谢物,例如霉菌毒素等,应当引起重视。微生物生长和代谢所需的氧大部分来自气相,也有部分存在于与固体基质混合在一起的水中。所以固体发酵常涉及气、固、液三相,使情况变得非常复杂。固体发酵的气体传递速率比液体发酵高得多,因为固体发酵中固体颗粒提供的液体表面积比深层发酵中气泡提供的界面大得多。由于固体发酵是非均相反应,测定和控制都非常困难,可用于工程设计的参数较少,因此过去大部分发酵过程都依赖经验。随着科学技术的发展和计算机的应用,近来关于固体发酵过程的传热、传质和数学模型放大方面的研究成果显著。

(2)液体发酵法 液体发酵又分液体表面发酵法液体深层发酵法两种。其中液体深层发酵是现代普遍采用的方法,我国酶制剂、抗生素、氨基酸、有机酸和维生素等发酵均采用此法生产,而液体表面发酵法实际上已被淘汰。

液体表面发酵法(又称液体浅盘发酵法静置培养法):本法是将已灭菌的液体培养基接入微生物菌种后,装入可密闭的发酵箱的浅盘中,薄薄一层,液体厚度为1~2cm,然后向盘架间通入无菌空气,通过浅盘培养基的表面供给氧气,并维持一定的温度进行发酵。用此法发酵无需搅拌,动力消耗少,但培养基的灭菌须在另外的设备中进行。缺点是控制杂菌污染较难,所需场地较大。

液体深层发酵法:本法是目前酶制剂发酵最为广泛应用的方法,所用主要设备——发酵罐是一个具有搅拌桨叶和通气系统的密闭容器。发酵罐的容量,多采用10~60t,也有采用100t以上的。目前从培养基灭菌、冷却到发酵都在同一罐内进行。液体发酵法生产酶制剂的工艺技术,目前采用分批(间歇)发酵法,也有人主张在酶的生产中尝试下面另外两种方式。

分段式培养(two-steps culture或sequential culture):是根据生产菌在生长阶段和产酶阶段对培养条件要求不同加以区别对待的一种培养。以灰色链霉菌(Streptornyces griseus)生产α-甘露糖苷酶为例,该菌可先用富集培养基在28℃进行培养,使菌体充分生长。17h后,分离取出菌体,洗净,再转入含有酵母α-甘露聚糖作为诱导物的稀盐培养液中进行培养,让酶大量诱导合成。这样18~24h后,α-甘露糖苷酶的浓度就能达到最高水平,产量远高于批量式发酵。由于这是一种“针对性”的培养,营养物质浪费少,有人认为这对酶的生产来说是很有前途的一种培养方式。但也有异议,因为从总体看,这种培养获得的产量不一定最高,而且不适合大规模生产。

连续发酵(continuous culture):即先将菌体培养至某一生长阶段,例如,对数期,然后一方面连续添加新鲜的培养基,另一方面又不断以相同速度放出培养产物。添加和放出速度应与生长产酶速度一致,使菌体始终处于恒态条件下生长和产酶。连续发酵的优点是可以大大提高劳动生产率,同时还可能打破酶合成过程中的反馈阻遏,使产酶率显著提高。例如,用野生型的铜绿色极毛杆菌(Pseudomonas aeruginosa)生产酰胺酶,乙酰胺等可以诱导它的合成,但乙酸等能阻遏其产生。在乙酰胺等诱导物存在的条件下进行批量式发酵时,产酶率为每毫克菌体每分钟产酶5~10U;但如果在同样条件下进行连续发酵,那么产酶率可提高12倍以上。连续发酵的关键是如何避免染菌和菌株变异。连续发酵现也常用于突变株筛选。这一方法若获得成功,将会大大提高酶制剂工业技术水平和经济效果。

综上所述,固体发酵法与液体发酵法相比各有其利弊,二者主要优缺点归纳如表4-1所示。

表4-1 固体发酵与液体发酵的主要优缺点

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