（一）毕赤酵母表达系统

虽然原核表达系统具有生长迅速、成本低廉等优点，但在表达很多真核细胞来源的蛋白质时却无法达到期望效果。因此人们开发了一些真核表达系统，其中使用最广泛的是毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统。

毕赤酵母是分子生物学中用于重组蛋白表达的标准工具之一，在大规模发酵生产重组蛋白中得到了广泛应用。二十多年前作为一个将甲醇转换为动物饲料蛋白源的生物系统，如今已发展成为两个重要生物工具：用于细胞生物学研究的真核模式生物和用于重组蛋白生产的表达系统。在毕赤酵母中实现异源表达的酶种类很多，如许多脂肪酶在原核表达系统中很难正确折叠，大多数都存在于包涵体中，但是在毕赤酵母中的表达效果却很好。在毕赤酵母中成功表达的还有Lensites gibbosa漆酶、海栖热袍菌（Thermotoga maritima）木聚糖酶、米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）葡聚糖酶、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）弹性蛋白酶、嗜热拟青霉（Paecilomyces thermophila）葡萄糖苷酶、黄曲霉（Aspergillus flavus）阿魏酸酯酶、土生菌（Humicolagrisea）纤维二糖水解酶、巴伦葛茲类芽孢杆菌（Paenibacillus barengoltzii）半乳糖苷酶、樟绒枝霉（Malbranchea cinnamomea）角质酶等多种酶。迄今已有200多种蛋白质在毕赤酵母中实现了高效表达。

1.毕赤酵母的基本特点

毕赤酵母成为一个高效的外源基因表达系统，有几个重要的因素促使其被迅速认可和接受，其中最重要的原因包括：①来源于毕赤酵母乙醇氧化酶（AOX1）的启动子特别适用于控制外源基因表达；②毕赤酵母和酿酒酵母所需的分子遗传操作技术非常相似；③毕赤酵母对呼吸增长有强烈偏好，这个重要的生理特性可促使其在高细胞密度情况下培养。1993年，菲利普斯石油公司决定将毕赤酵母表达系统向学术研究实验室开放，促使毕赤酵母系统知识库爆炸式扩增。毕赤酵母是一种单细胞微生物，很容易操作和培养。同时，它也是真核生物，有能力执行更高的真核细胞蛋白质水解加工、折叠、二硫键形成和糖基化等很多翻译后修饰。因此，许多在细菌系统中处于非活性状态包涵体的蛋白质在毕赤酵母中可以成功作为生物活性分子表达。毕赤酵母系统一般比衍生于高等真核生物的表达系统（如昆虫和哺乳动物组织培养细胞系统）更快、更容易培养和成本更低，而且通常表达水平也更高。

毕赤酵母作为甲基营养酵母，能代表可代谢甲醇的两个不同属（毕赤酵母属和假丝酵母属，其中包括约30个酵母物种）酵母种类。在所有酵母中的甲醇代谢途径似乎都相同，代谢的第一步是甲醇氧化形成甲醛，这个过程通过乙醇氧化酶（AOX）来实现。在毕赤酵母中有两个基因分别编码乙醇氧化酶：AOX1和AOX2。AOX1基因在细胞内负责绝大多数乙醇氧化酶的活性，AOX1基因表达的特点是严格调控和由甲醇诱导的高水平表达。在甲醇诱导的摇瓶培养条件下，其表达水平通常是总可溶性蛋白的5%，但在细胞中添加甲醇且在发酵罐中扩大培养时可以达到30%。AOX1基因的表达可在转录水平上控制。在甲醇环境下生长的酵母细胞中约有5%的polyA+RNA来自AOX1基因，然而在其他碳源条件下生长的细胞中则检测不到AOX1信息。AOX1基因的调控类似于酿酒酵母GAL1基因的调控，在这个控制过程中似乎涉及两种机制：抑制/去抑制机制和诱导机制。然而，与GAL1调节不同，去抑制条件（例如培养基中缺少抑制碳源，如葡萄糖）不会导致大量AOX1基因的转录，甲醇的存在对诱使高水平的转录很重要。

2.异源蛋白的分泌

异源蛋白可以在毕赤酵母细胞内表达或分泌到培养基中。由于毕赤酵母只能低水平地分泌内源性蛋白质，而其培养基中又不包含蛋白质，因此培养基中的绝大多数蛋白质是分泌的异源蛋白。分泌需要针对异源蛋白分泌途径的信号序列存在，虽然已有几个不同分泌信号序列成功使用，包括存在于某些异源蛋白自身的分泌信号，但是这些分泌信号序列的效果并不是十分理想，其中效果最好的是酿酒酵母α因子分泌信号序列。

3.表达菌株的来源

所有毕赤酵母表达菌株都是NRRL-Y 11430菌株的衍生物，其中大部分在组氨醇脱氢酶基因（HIS4）中有一个突变，允许通过转化包含HIS4的表达载体进行筛选。也有一些其他生物合成基因/营养缺陷型的突变体菌株，但实际应用较少。所有这些菌株都可以在复合培养基中培养，但需要在基本培养基中补充组氨酸（或其他适当的养分）。

毕赤酵母有三种类型，它们利用甲醇的能力因其含有或删除的AOX基因不同而不同。有些已删除AOX基因的菌株比野生型菌株能更高效地生产异源蛋白。大量甲醇存在重大的安全隐患，一些突变菌株生产过程中仅需要很少甲醇来诱导表达，因此适合用于大型发酵罐培养。第一种类型是GS115（his4），也是目前最常用的表达宿主，是一个带有AOX1和AOX2基因的野生型菌株，在添加甲醇的条件下以野生型菌株的生长速率快速生长（[Mut+]表型）。第二种类型是KM71（his4arg4aox1d::ARG4），KM71是一株AOX1基因大部分被删除并被替换为酿酒酵母ARG4基因的菌株，这个菌株必须依靠乙醇氧化酶中很弱的AOX2基因，在甲醇环境下以较慢速度生长[（Muts）表型]。许多毕赤酵母表达载体可以在插入表达框的同时敲除Mut+突变菌株的AOX1。第三种类型是MC100-3（his4arg4aox1d::SARG4aox2d::Phis4），它没有两个AOX基因，因而完全无法在甲醇（[Mut-]表型）环境中生长。

在发酵罐培养中，由于高细胞密度环境和小部分细胞的裂解，液泡蛋白酶被释放到培养基中并在异源蛋白降解过程中发生主要作用，因此部分分泌的异源蛋白是不稳定的。一些蛋白酶缺陷的宿主菌株有助于减少异源蛋白的降解，如SMD1163（his4pep4prb1）、SMD1165（his4prb1）和SMD1168（his4pep4）是蛋白酶缺陷型菌株，都可以提供更适合表达某些异源蛋白的环境。

4.表达载体

毕赤酵母中为异源蛋白表达设计的质粒载体上有一个外源基因表达框，其中含毕赤酵母AOX1启动子、一个或多个独特的异源基因限制性位点以及转录终止序列。这些载体大多包含毕赤酵母HIS4基因作为转入毕赤酵母his4突变型宿主的一个可选标记，同时还含有需要在细菌（即ColE1复制起源和氨苄青霉素抗性基因）中进行质粒复制和保存的序列。一些载体也包含了AOX13′侧翼序列，它源自毕赤酵母基因组AOX1基因近3′端的区域，可用于指导将包含外源基因表达框的片段整合到AOX1基因位点，通过基因置换或插入到AOX1基因的3′端。当用于分泌外源蛋白时，需要在载体上紧接AOX1启动子的区域插入分泌信号序列。

有些载体具有显性抗药标记，允许在转化过程中收到外源基因表达框的多拷贝菌株的富集。pPIC3K和pPIC9K两个载体包含细菌卡那霉素抗性基因，并赋予包含这些载体的多个拷贝菌株对高水平G418的抗性。另一组载体pPICZ系列包含源于一株异壁链霉菌属菌株Streptoalloteichus hindustanus的Sh ble基因，这一基因可以赋予大肠杆菌、酵母（包括毕赤酵母）和其他真核生物等宿主对药物博来霉素（zeocin）的抗性。可以将一个表达框的多个拷贝引入到这些载体中，通过插入一个周围是BamHI和BglII位点的表达框到已经包含一个单独表达框拷贝的载体BamHI位点，由此产生两个表达框之间BamHI/BglII融合序列不能被两种酶中的任何一种切开的情形，因此允许另一个BamHI-BglII周围表达框插入相同的载体，以生成一个带有三个表达框拷贝的载体。重复这一过程直到6～8个盒式表达载体的拷贝插入最终载体中，然后将这一载体转化进入毕赤酵母宿主。

近期，研究人员也开发出了一些其他类型的启动子。与AOX1启动子不同，这些启动子不需要甲醇诱导。如源自毕赤酵母3-磷酸甘油醛—脱氢酶基因（GAP）的组成型强启动子。除了不涉及甲醇，宿主在培养时不需要更换发酵碳源来诱导外源基因表达，因此GAP启动子使用非常方便。然而，这个启动子并不适合用来表达对毕赤酵母而言有毒的外源基因，因为恒定的高水平表达可以导致不表达目标蛋白的衍生株产生，这样的菌株已失去了表达载体，或者获得了减少或消除外源基因表达的基因突变。另一个启动子源自毕赤酵母中的甲醛脱氢酶基因（FLD1）。毕赤酵母在以甲醇或某些甲基胺（如甲胺）作为唯一氮源的环境下生长时需要甲醛脱氢酶，甲醇或某些甲基胺可强烈诱导FLD的表达。在含有葡萄糖和铵离子的培养基中，由FLD1启动子控制的外源基因表达被压抑，但可以使用含有甲醇或甲胺的培养基独立地诱导。GAP和FLD1启动子表达外源基因的水平与AOX1启动子表达的相当。

5.载体的整合

与酿酒酵母一样，线性载体可以通过载体与毕赤酵母基因组的同源重组产生稳定转化。这种整合在没有选择性压力，甚至存在多拷贝时显示出较强的稳定性。所有毕赤酵母表达载体都携带至少一个毕赤酵母DNA片段（启动子片段）和可以切开的独特限制位点来引导载体通过单交叉插入整合到宿主基因组中。包含毕赤酵母HIS4基因的载体还可直接整合入毕赤酵母基因组his4位点。包含3′AOX1序列的表达载体可以在AOX1或HIS4位点通过单一交叉方式或者基因置换方式整合到毕赤酵母基因组中。基因置换发生在载体和基因组的AOX1启动子和3′AOX1区域，导致AOX1编码区域的删除。来源于这种AOX1置换的转化子是表型His⁺和Muts，其中Muts株有时表达高水平的外源蛋白。此外，Muts表型可作为方便的指标器以确认毕赤酵母基因组中整合表达框的存在。

无论是单个交叉或基因置换整合策略和His⁺转化子的选择，都有相当比例的转化子不包含这些表达载体。这可能是由于载体的HIS4基因和毕赤酵母his4位点之间的基因转换导致野生型HIS4基因重组到没有任何额外载体的序列基因组中。

6.翻译后修饰

毕赤酵母可以完成很多通常与高等真核生物相关的翻译后修饰，这些包括信号序列的加工、折叠、形成二硫键以及O-和N-连接的糖基化。由毕赤酵母和其他真菌分泌异源真核生物蛋白质的糖基化会带来一些问题。在哺乳动物中，O-连接寡糖是由不同种类的单糖组成，包括N-乙酰半乳糖胺、半乳糖和唾液酸等。与此相反的是，在较低等的真核生物（包括毕赤酵母）中，O-低聚糖只是连接的甘露糖（Man）残基。在毕赤酵母中，每条链中甘露糖残基的数量、连接方式、频率以及O-糖基化的特异性都不确定。

毕赤酵母和其他真菌中的N-糖基化模式与高等真核生物是不同的。所有真核生物中，从内质网开始，随着脂质连接低聚糖单元（Glc3Man9GlcNAc2；Glc=葡萄糖，GlcNAc=乙酰葡萄糖胺）转移到识别序列Asn-X-Ser/Thr上的天冬酰胺分子上，这个低聚糖核心单位随后被剪辑成Man8GlcNAc2。不同真核生物的糖基化模式正是在这一步骤开始分化。哺乳动物的高尔基体执行一系列剪辑和加成反应，生成由任一种Man5-6GlcNAc2（高甘露糖型）、几种不同糖的混合物（复合类型）或这两个的组合（混合型）组成的低聚糖。在毕赤酵母分泌异源蛋白质的过程中存在这两种不同模式的N-糖基化。

对于酿酒酵母转化酶等一些蛋白质，其糖基化糖类结构在大小、结构和核心单元（Man8-11GlcNAc2）方面均存在类似。通过电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western Blot）证实毕赤酵母系统表达的其他异源蛋白质糖基化程度较高。值得注意的是，毕赤酵母不能添加1，3-末端甘露糖到低聚糖链中，这与酿酒酵母低聚糖形成鲜明对比（1，3-末端甘露糖是其常见的糖基化形式）。

7.在发酵罐中的表达(www.daowen.com)

在发酵罐中，毕赤酵母异源蛋白质的表达水平通常比摇瓶中高很多。发酵罐培养可以获得高产量的主要原因：①只有在可控环境下酵母细胞才可能增长到高细胞密度（细胞干重＞100g/L），而培养基中分泌蛋白质的浓度与培养液中的细胞浓度大致成正比；②毕赤酵母细胞在添加甲醇的限速发酵罐中培养，从AOX1启动子发起的转录水平能达到相当于在过量甲醇中细胞培养的3～5倍；③甲醇代谢利用氧的比率高，外源基因的表达受到氧供给限制的不利影响，而在发酵罐的受控环境下，准确地监测和调整培养基中的氧气含量是可行的。

毕赤酵母系统的一个特点是表达菌株的发酵规模容易从摇瓶放大到高密度发酵罐发酵。迄今已有许多关于毕赤酵母表达菌株高细胞密度发酵技术优化方面的研究报道，已开发出各种各样分批补料和连续培养的方案。所有方案都涉及菌株在甘油组合培养基中的初始生长，在此期间生长是迅速的，但外源基因的表达被完全抑制，在甘油损耗后启动一个过渡阶段。在生长限速的条件下添加甘油到培养体系，最后加入甲醇或甘油和甲醇的混合物以诱导表达。

【应用实例】下面以编者课题组采用毕赤酵母表达脂肪酶为例，简要介绍毕赤酵母表达系统的操作流程。

表达过程分为目的基因扩增、重组表达载体的构建、电击转化毕赤酵母GS115、诱导表达、高拷贝筛选以及发酵瓦罐高密度发酵（图3-5）。

图3-5 毕赤酵母表达脂肪酶操作流程图

（1）目的基因扩增 根据脂肪酶基因序列设计引物，PCR扩增目的片段，PCR产物经切胶回收后，连接克隆载体pMD-19T，验证目的基因是否扩增正确。

（2）重组表达载体的构建 目的片段及质粒pPIC9K分别用同样的限制性内切酶进行双酶切处理，连接转化克隆宿主DH5α后，于37℃培养箱中过夜培养，菌落PCR验证插入片段大小，并测序验证。

（3）电击转化毕赤酵母GS115重组质粒经线性化及醇沉回收后，电击转化至毕赤酵母GS115细胞，涂布在MD平板上于30℃培养箱中倒置培养2～3d，直至长出菌落为止。

（4）诱导表达 挑取MD培养基平板上的单克隆菌落，经BMGY培养基（buffered glycerol-complex medium）培养后，用BMMY培养基（buffered methanol-complex medium）培养诱导表达。诱导培养72h后取上清液测定酶活力，SDS-PAGE分析蛋白质表达情况。

（5）G418板高拷贝筛选 将MD板上的转化子用无菌水轻轻刮下，梯度稀释后分别涂布于G418（geneticin，遗传霉素）浓度为1.0、2.0、3.0和4.0mg/mL的平板上，于30℃培养箱培养，直至长出单菌落。然后用同样的方法进行诱导表达，筛选酶活力较高的转化子。

（6）发酵罐高密度发酵 筛选到酶活力较高的转化子后，进行发酵罐高密度发酵产酶。发酵初期，补加甘油至菌体湿重达到200g/L（5L发酵罐）或300g/L（10L发酵罐）。停止补料，饥饿30min，待溶氧上升并保持稳定后开始补加甲醇进行诱导产酶。发酵7d，当酶活力有所下降时即停止发酵。

（二）丝状真菌表达系统

许多丝状真菌细胞不经过改良就可以生产大量胞外酶，在工业上常被选为酶制剂生产的菌株。丝状真菌，如曲霉属（Asperqillus spp.）和木霉属（Trichoderma，spp.）真菌，可以分泌很高水平的蛋白质。例如，黑曲霉（Aspergillus niger）能够分泌25～30g/L葡糖淀粉酶，里氏木霉（Trichoder mareesei）能够分泌100g/L胞外蛋白。

目前，丝状真菌有四种常见的转化策略：①有原生质体介导的方法，涉及使用降解细胞壁的酶以及通过聚乙二醇（PEG）和氯化钙来吸收外源DNA，这种方法的不足之处在于转化效率受分解酶的影响，需要再生过程；②借助农杆菌（Agrobacterium）介导的转化策略；③利用电动脉冲介导的可逆膜透化作用促进DNA吸收，这种转换方法也需要准备原生质体；④将包裹DNA的高速金属颗粒射入细胞，从而避免去除细胞壁。

由丝状真菌表达的酶制剂已广泛应用于食品工业中。由美国食品与药物管理局（FDA）公布的GRAS（generally regarded as safe）食品添加剂名单中包括了黑曲霉、米曲霉（Aspergillus oryzae）、寄生内座壳（栗疫菌）（Endothia parasitica）、米黑毛霉（Mucor miehei）、微小毛霉（Mucor pusillus）等丝状真菌生产的酶。被美国FDA批准的由丝状真菌生产的酶种类很多，其中包括果胶酯酶、外肽酶、果胶裂解酶、天冬氨酸蛋白酶、木聚糖酶、葡糖氧化酶等。更多的信息可以到其官方网站上查阅（http://www.accessdata.fda.gov/scripts/fcn/fcnNavigation.cfm?rpt=grasListing）。国内允许使用的真菌及其来源的酶种类相对较少，主要有黑曲霉、米根霉（Rhizopus oryzae）、米曲霉、特异腐质霉（Humicola insolens）、里氏木霉（Trichoderma reesei）、米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）和微小毛霉（Mucor Pusillus）等20余种，酶类主要有脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶、乳糖酶、木聚糖酶、普鲁兰酶和葡萄糖氧化酶等30余种。本书附录二是GB 2760—2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中所列允许使用的真菌及其表达的酶类。

丝状真菌表达系统的缺点是转化频率相对较低、存在潜在形态缺陷、蛋白酶活力产生的蛋白质修饰和低pH等。大多数非真菌（哺乳动物、细菌、鸟类、植物等）重组蛋白质的表达水平在丝状真菌中普遍较低，而真菌的蛋白质表达水平较高。其瓶颈可能是在转录和翻译水平的分泌，也可能是在翻译后水平（即低效的易位、折叠、运输、处理或分泌）。

【应用实例】下面以黑曲霉为例介绍丝状真菌外源基因表达系统的主要操作过程及影响表达效率的关键因素。

外源基因导入黑曲霉基因组的方法有很多，比如传统的原生质体法、电击转化、醋酸锂转化法等方法。农杆菌介导转化法因其具有转化材料范围广、转化率高、单拷贝比例高和转化子稳定等优点，是目前应用最广泛的方法之一。农杆菌介导转化黑曲霉的过程如图3-6所示，主要包括双元表达载体的构建、农杆菌与黑曲霉共培养和转化子筛选等步骤。

图3-6 黑曲霉表达外源基因的流程示意图

影响丝状真菌能否成功转化的因素有很多，包括宿主种类、农杆菌种类、诱导剂浓度和共培养条件等。因丝状真菌的复杂性，目前已报道的研究中针对不同种类的宿主的最适转化条件均是通过试验摸索而获得。根据产生的冠瘿碱种类的不同，根癌农杆菌主要有章鱼碱型、胭脂碱型、农杆碱型和琥珀碱型，农杆菌的毒力强弱依次为：农杆碱型菌株＞琥珀碱型＞胭脂碱型菌株＞章鱼碱型菌株。研究表明，毒力较强的菌株具有较高的转化效率，而有的菌株无法对特定的丝状真菌实现转化。通常使用农杆菌LBA4404或AGL1为介导黑曲霉转化的菌株。携带双元表达载体的农杆菌需要一定浓度的乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）诱导vir基因表达，产生多种毒力蛋白质实现转化。

影响农杆菌介导转化黑曲霉的关键因素是共培养条件。农杆菌与黑曲霉的浓度比例明显影响其转化效率，过高浓度的农杆菌会因其过度生长引起严重的污染，从而导致转化率大大下降；当黑曲霉浓度过高时，则会导致生长过于旺盛以至于无法挑选到转化子，并且还会导致转化率降低。农杆菌的最适生长温度为28℃，但侵染的最适温度通常在22～25℃。此外，农杆菌与黑曲霉的共培养时间也影响转化效率，通常为24～48h。培养时间过短会使转化率降低而挑选不到转化子；培养时间过长则可能导致假阳性的产生，并且还可能因为农杆菌过度生长而引起污染。另外，如选用潮霉素B（hygromycin B）为筛选标记，还应考虑黑曲霉在其抗性下的最小生长浓度，便于筛选转化子。

获得黑曲霉转化子后，可提取其基因组，对目的基因进行PCR验证。如需表达酶蛋白，可设计特定培养基对转化子进行摇瓶发酵实验，测定其发酵液酶活力，判断酶蛋白的表达水平。