1.大肠杆菌表达系统

在酶基因的众多表达系统中，大肠杆菌表达系统一直占据主导地位。无论在实验室的研究工作中，还是在商业化的产品开发过程中，大肠杆菌表达系统一直是首选的蛋白质表达方法。而且，由于这个系统具有简单高效的特点，通常作为衡量其他表达系统效率的标准。

常用的大肠杆菌表达质粒有pET系列质粒、pQE系列质粒和pGEX系列质粒等。这些质粒系统的共同特征是都有复制起始位点、选择性标签（氨苄、卡那、氯霉素抗性）、多克隆位点以及启动子序列（T7、T5或者Tac启动子）。常见的大肠杆菌菌株有BL21（DE3）、Rosetta（DE3）、Tuner（DE3）、ADA494（DE3）和Origami（DE3）。这些菌株都是λ噬菌体DE3的溶原菌。DE3上携带T7RNA聚合酶基因，这个工程菌可以用来过量表达由T7启动子控制的目标蛋白。T7RNA聚合酶基因由lacUV5启动子控制，因此其表达需要IPTG诱导。酶在大肠杆菌中的表达流程如图3-4所示。

图3-4 酶在大肠杆菌中的表达示意图

在很长一段时间内大肠杆菌仅仅用来在细胞内表达目标蛋白质，被认为是其主要缺点之一。分泌表达的产物，其分离纯化比较简单，因此生产成本比胞内表达要低很多。近年来人们发现大肠杆菌本身自带分泌蛋白质的能力，还以此为基础开发了一些具有分泌能力的工程菌，而这些工程菌的构建可通过以下方法来实现：①改造大肠杆菌中本身已有的分泌系统；②引入功能已知的载体蛋白；③改造大肠杆菌的细菌包被；④共同表达溶菌酶蛋白。例如，大肠杆菌缺乏糖基化和其他类型的翻译后修饰系统，研究人员在革兰阴性菌弯曲杆菌（Bacterium campylobacter）中发现了N-连接糖基化系统，并成功地将该系统转移到了大肠杆菌中。大肠杆菌表达系统的另一个缺点是抗生素依赖性。抗生素常用来施加选择性压力，以提高菌体中所带质粒的稳定性，但这会提高生产成本，并且大规模使用时会导致具有抗生素耐受性的超级细菌的产生，因此对生态环境存在潜在风险。为了克服这些弊端，研究人员开发出不依赖抗生素的质粒/宿主系统。在这个系统中，细胞存活必需的编码翻译起始因子IF1从宿主染色体中敲除并整合到质粒中。这样，质粒的存在成为宿主细胞生存的必要条件，而缺少质粒的宿主细胞将无法存活，从而达到维持质粒的目的。由于IF1非常小，只有71个氨基酸残基，因而插入IF1的载体大小变化不大，由此产生的代谢负担也不大。与之相似的系统还有整合烯酰ACP还原酶fabI的质粒，带有此质粒的菌株对生物杀灭剂和三氯苯氧氯酚的毒性有抵御能力。因此，可以通过生物杀灭剂和三氯苯氧氯酚的抗性来进行菌株筛选。

此外，陆续开发出来一些独立于外源毒素的质粒系统，如CCDB/CCDA系统。在这个系统中，毒素基因（ccdB）被整合到宿主染色体，产生的毒素是由100个氨基酸组成的稳定蛋白。这种毒素可以结合DNA促旋酶并损害DNA复制从而引起细胞死亡。对这种毒素的拮抗作用是通过含有抗毒素基因ccdA的质粒来实现的。因此，质粒丢失会导致细胞死亡。理论上，任何必需基因/途径都可能被用于构建质粒维持系统。例如，基于赖氨酸前体L，L 2，6-diaminopimelate合成的质粒维持系统。在这个系统中，L，L2，6-diaminopimelate必需基因被整合到质粒中成为宿主代谢系统中不可缺少的部分，从而保证质粒在培养过程中不会丢失。

大肠杆菌宿主菌的修饰有助于减少蛋白质水解、促进折叠和形成正确二硫键，因此能极大地影响蛋白质的质量和产量。目前已有许多敲除蛋白酶基因提高靶蛋白产量的例子，例如，采用蛋白酶缺陷型大肠杆菌菌株成功提高了A型β-内酰胺酶的融合蛋白产率。Park等采用类似的方法提高了重组蛋白的活性，比用大肠杆菌亲本菌株表达的蛋白质活性高30%。此外，蛋白酶敲除的组合可以进一步提高蛋白质产量。然而，不能总是从所表达的重组蛋白的一级氨基酸序列来确定哪些蛋白酶缺失可以提高靶蛋白的质量和/或产量，因此需要筛选几种不同的蛋白酶缺失突变体，以确定提高产量的最佳突变体。

在大肠杆菌中，分子伴侣共表达可以提高重组蛋白的产量，包括分子伴侣和折叠调节蛋白，如GroEL/ES和DnaKJ/GrpE复合体等。已经发现在某些情况下表达分子伴侣能增加易沉淀蛋白质的可溶性。共表达分子伴侣GroEL/ES能增强伯克霍尔德杆菌的脂肪酶在大肠杆菌中的表达，同时伴侣蛋白DnaK和DnaJ的共表达能促进折叠过程并减少镁转运子CorA形成包涵体。在大肠杆菌的细胞质中，GroESL和DnaJK/GrpE的共表达可以提高重组蛋白Cryj2（一种柳杉花粉过敏原）的稳定性和产量，而GroESL和DnaK的共表达可以提高大肠杆菌中人源胶原酶的表达量达10倍以上。

除了共同过表达伴侣蛋白与靶标，通过二硫键异构酶或氧化还原酶的表达可以提高折叠或二硫键连接的蛋白质活性。过表达大肠杆菌二硫化物异构酶及DsbC或DsbG可以提高在大肠杆菌中的单链Fv抗体的可溶性和功能。几种分子伴侣已经被证实能提高重组蛋白的质量。当共同过表达时，通过检查目标氨基酸序列来确定哪个折叠调节器协助可溶活性蛋白的表达是尚不完善的，但是蛋白质序列和结构的性质可以提供一定线索。

2.枯草芽孢杆菌表达系统

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种重要的原核表达宿主，具有很高的应用价值，其培养简单快速，具有较强的分泌蛋白质能力、非致病性及良好的发酵基础和生产技术，是生产一些工业用酶，如淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等的理想表达宿主，是微生物研究领域中一种重要的模式菌株。但是枯草芽孢杆菌表达系统迄今仍然存在不完善的地方，大部分外源蛋白在其体内表达水平仍旧不高，这主要是因为：①枯草芽孢杆菌在其对数生长末期表达和分泌大量的蛋白酶，影响外源蛋白的稳定性和产量；②质粒的分化和结构具有不稳定性，有时外源蛋白的组成型表达会影响质粒的稳定性；③毒性蛋白在其体内不易表达；④有些外源蛋白的表达分泌到培养基中会影响宿主菌的生长；⑤与大肠杆菌相比，分子遗传操作较困难。这些因素都限制了枯草杆菌表达系统的发展。外源蛋白在枯草芽孢杆菌中的高效表达是实现其在工业上应用的重要途径，而使用可控制的强启动子是外源蛋白高效表达的关键因素之一，决定着工业酶的大规模生产。

枯草芽孢杆菌168菌株的基因组全序列测序工作已于1997年完成，但到目前为止，其基因组中尚有近50%的基因功能仍未被阐明。因此，针对枯草芽孢杆菌中的基因及相关元件功能，以及其对内部及外界环境响应的研究仍是该菌株基础研究的重点。枯草芽孢杆菌应用得最为广泛的宿主菌是枯草168菌株，已知该菌株可产生8种胞外蛋白酶（其中不包括一些未发现的蛋白酶），利用基因突变的方法失活枯草168菌株基因组上中性蛋白酶、碱性蛋白酶、金属蛋白酶、胞内蛋白酶、芽孢杆菌肽酶F以及中性蛋白酶B六种蛋白酶基因后，将该菌株命名为WB600，其蛋白酶活性仍保留野生型菌株的0.32%。WB700是在WB600的基础上将丝蛋白酶基因vpr在内的7个蛋白酶基因全失活的突变株，其蛋白酶活力是野生菌株的0.1%。随后，来自加拿大卡尔加里大学的Wong等在WB700的基础上，继续将枯草杆菌的胞壁蛋白酶基因cwp失活，发展了在野生菌株的基础上缺失了8个蛋白酶基因的胞外蛋白酶活性更低的WB800菌株。因此，现在用于外源表达目标蛋白的枯草芽孢杆菌菌株，大部分使用的是枯草168系列的突变株。

枯草芽孢杆菌168系列菌株已成为研究枯草芽孢杆菌的标准菌株。大部分枯草芽孢杆菌不含有内源性质粒，如今常用的质粒大部分来自于葡萄球菌（Staphylococcus）和链球菌（Streptococcus）。这些质粒载体可在枯草芽孢杆菌中自主复制，根据其复制方式可分为滚环复制型载体（rolling circle-type replication vectors）和θ复制型载体。大部分来自于革兰阳性细菌的小质粒载体（＜12kb）是通过滚环复制机制复制的，而一些大的质粒载体是通过θ复制机制复制的。如最开始鉴定的来自于金黄色葡萄球菌（S. aureus）的4个质粒pUB110、pC194、pE194和pT181都是通过滚环机制复制的。pUB110带有卡那霉素的抗性基因，拷贝数较低，每个细胞中有30～50个拷贝；pC194带有氯霉素的抗性基因，拷贝数约为15。pE194较特殊，是温度敏感性的质粒载体，32℃正常复制，随着温度增加，拷贝数降低，45℃时停止复制，这为人们纯化含有此类质粒的细胞提供了一个思路。另一方面，pE194可以在细菌基因组上多个位点发生特异性整合，整合子可以通过抗性（红霉素）和培养温度（50℃）进行筛选。pT181带有四环素的抗性基因，每个细胞中约有20个拷贝。

这些质粒一般可以在枯草芽孢杆菌中自主复制，表达其抗性基因，但在传代培养中仍存在许多问题，其中最大的问题是质粒的分离不稳定性和结构不稳定性。分离不稳定性表现为细胞在无筛选压力条件下质粒易丢失；结构不稳定性包括质粒DNA的重排、筛减和增加。质粒载体的不稳定性严重影响了其在枯草芽孢杆菌中的研究应用，如许多基因不能直接构建在枯草芽孢杆菌质粒载体上，而转入宿主菌进行表达。然而，大肠杆菌分子遗传操作成熟，不会产生质粒不稳定性现象，所以构建大肠杆菌—枯草芽孢杆菌的穿梭质粒载体是十分必要的，这样就可以将外源基因在大肠杆菌中构建完成后再转化到枯草芽孢杆菌中表达。目前常用的穿梭质粒载体有pEB10、pEB20、pEB60、pUB18、pUB19和pWB980等。

芽孢杆菌中高效表达外源蛋白的最大障碍是构建的重组表达质粒在宿主菌中通常不稳定，解决这一问题的有效途径是使用整合型载体。枯草整合型质粒载体一般含有大肠杆菌质粒的复制起点（通常为pBR322或其衍生质粒）、抗性筛选标记基因（常用于枯草芽孢杆菌的标记基因有卡那霉素、氯霉素、红霉素等）及一段或两段整合基因（即与宿主细胞染色体序列同源的基因）。它的特点是限制性复制，即整合型质粒只在大肠杆菌中有复制功能，转入革兰阳性细菌，如枯草芽孢杆菌中，则无此功能，因此只有整合进宿主基因组中才能正常地表达目标基因。整合型质粒载体根据其整合方式不同可分为单交换整合和双交换整合。(www.daowen.com)

启动子是位于结构基因5′端上游的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地结合并具有转录起始的特异性。启动子是实现外源基因高效表达的关键。依照控制转录水平的高低，启动子可以分为强启动子和弱启动子；从启动子诱导机制上分类，启动子可以分为组成型启动子、诱导型启动子、时期特异性启动子及自诱导启动子。

枯草芽孢杆菌中最常见的是IPTG诱导的乳糖启动子，IPTG能够与大肠杆菌的转录阻遏蛋白LacI结合，使LacI从操纵位点上脱离，从而诱导下游基因的表达。最早应用的是启动子Pspac，由枯草芽孢杆菌噬菌体SPO1和大肠杆菌lac操纵子融合而成。随后Phan等将热激蛋白GroES和GroEL编码序列的强启动子与lac操纵子融合，构成IPTG诱导的启动子Pgrac。Phan等进一步通过优化启动子Pgrac的调控元件，构建另一个更强的启动子Pgrac100。虽然受IPTG诱导的启动子强并且可控，但它存在以下3个缺点：①IPTG价格昂贵，有毒性，不适宜进行大规模外源蛋白的发酵生产；②Pspac启动强度仍然不够，外源蛋白的表达量不是很高；③Pspac不属于严紧的可控启动子，从而导致在未加入诱导物IPTG的情况下，仍然有少量的重组蛋白表达。因而这些由IPTG诱导的启动子不适用于工业上大规模蛋白酶的生产。枯草芽孢杆菌中第2个启动子系统是以木糖为诱导物的启动子Pxyl。Pxyl由xylR编码的阻遏蛋白严格控制表达，通过添加0.1%～2%的木糖，能够诱导该启动子表达，木糖启动子系统对代谢中的大部分代谢产物不敏感，不过却受到葡萄糖的抑制。枯草芽孢杆菌中第3个启动子系统是以蔗糖为诱导物的sacB启动子，sacB的基因是枯草芽孢杆菌基因组上受蔗糖诱导调控的基因，编码外分泌的蔗糖果聚糖酶（levansucrase）。其启动子sacR转录起始是持续性的，不受蔗糖诱导的控制，但在无蔗糖的情况下，其表达强度比蔗糖诱导时降低99%。这三个启动子诱导系统在枯草芽孢杆菌中应用广泛，尤其是前两个系统，常被用作外源蛋白高效表达的元件；但它们共同存在一个缺点，就是所用的诱导物IPTG和木糖价钱昂贵，在工业生产中易增加成本，因此限制了在工业生产中的大规模应用。而蔗糖诱导启动子的启动强度相对较弱，无法在工业生产中高效表达目标蛋白。

转录组学分析显示，基因表达是有时期依赖性的。一些基因特异性地在对数生长期表达，而另外一些基因却在菌体进入稳定期后才被激活表达。应用这些时期特异性表达基因的调控元件来表达外源基因，可以避免添加外源的诱导物。目前有两个此类启动子用于外源基因的表达。一个是启动子PrpsF，特异性在对数期表达，利用此启动子已成功将来源于产气荚膜杆菌（Clostridium perfringens）的β-类毒素的基因进行了高效表达。另一个使用的启动子是在对数末期表达的PaprE。PaprE是σA依赖型的启动子，且它的活性被高度控制。

自诱导启动子在工业生产中具有优势。Lee等运用苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）伴孢晶体蛋白基因cry3Aa的启动子Pcry3Aa构建了枯草芽孢杆菌稳定期自诱导表达系统，并且通过对此启动子进行优化，外源蛋白lacZ的表达量较优化前提高了5倍。优化后的Pcry3Aa启动子可能会成为枯草芽孢杆菌表达系统的一个强的备选启动子。另外，Wenzel等利用启动子PmanP构建了适合高细胞密度发酵的自诱导系统。这种新型的枯草芽孢杆菌自诱导系统在工业生产上将不仅可以提高外源蛋白的产量，还可以降低生产成本。

目前，已有许多原核基因和真核基因在枯草芽孢杆菌中表达。已克隆的原核基因很多，如属于分子遗传学范畴的一些与质粒构建有关的抗性基因；与DNA结构有关的DNA重组、诱变、修复等相关基因；与基因表达及其调控有关的Sigma因子、Trna、正负调控基因等；与芽孢形成萌发有关的spoOA、spoⅡG基因等；以及与苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白相关的cry、cyt基因等；甚至有些与感受态、蛋白质分泌有关的Com、SecDF基因等。此外，还有一些工业生产用酶也成功地在枯草芽孢杆菌中表达，如碱性蛋白酶、中性蛋白酶A与中性蛋白酶B、α-淀粉酶、β-淀粉酶、支链淀粉酶、木聚糖酶、脂肪酶、β-半乳糖苷酶和真枯草多肽酶F等。

3.乳酸乳球菌表达系统

乳酸乳球菌（Lactoccocus lactis）是近年来开发的重要的革兰阳性细菌表达系统之一。相比大肠杆菌，其具有安全无毒（Generally Recognized as Safe，GRAS）和无内毒素等特征，是食品和医药生产中的重要工程菌。

NICE（nisin-inducible controlled gene expression）是在微生物中最广泛使用的可诱导蛋白质表达系统之一。除乳链菌肽诱导的启动子外，NICE包括乳酸乳球菌nis操纵子的调控元件。这个系统可以用于表达相对大量的蛋白质，表达量可高达300mg/L。近年来开发的其他诱导表达系统，如P170基因表达系统，不需要诱导子，从指数期到稳定期的过渡阶段，当pH降至6以下就能启动。采用这个表达系统，重组金黄色葡萄球菌核酸酶的表达量可达到300mg/L。中试级P170基因表达系统的产率与NICE系统相近，表明它可以作为NICE的替代系统。另一种表达系统是基于锌离子依赖的启动子，表达效率与NICE系统相似。这个系统是通过加入EDTA螯合锌离子并使其浓度降低到阈值以下而启动。

由于食品级蛋白质表达系统对产品的安全性要求高，因此需要在这些表达系统中去除抗生素选择标记物。和大肠杆菌中的质粒维持系统相似，这些不依赖抗生素的系统都是通过构建宿主生存必需的质粒来实现的。乳酸乳球菌表达系统的特点之一是其有效的蛋白质分泌系统。其中，由Usp45信号肽引导的分泌效率较高，使用Usp45信号肽后在乳酸乳球菌中表达的芽孢杆菌激酶几乎完全分泌到培养基中。

4.假单胞菌表达系统

荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）是一种生物安全水平1级的生物体。用荧光假单胞菌生产的几种蛋白质已经在美国和另外几个国家进入临床试验阶段。对于用于医疗和食品行业的酶，荧光假单胞菌的安全性尤为重要。在假单胞菌属中有一些自主复制质粒。这些质粒不仅可以表达目标蛋白质，还能表达一些调控蛋白质，从而实现对目标蛋白质表达水平的调控。已开发两种质粒用于荧光假单胞菌表达平台：RSF1010和pCN51。RSF1010中等拷贝数的质粒（每细胞30～40个）最早用于克隆感兴趣的目标基因，而后又被改造用于重组基因表达。RSF1010骨架包括四环素抗性标记基因tetR和tetA，使其可以选择荧光假单胞菌和大肠杆菌作为宿主细胞进行克隆，并在这些宿主之间穿梭。直接克隆到荧光假单胞菌细胞具有多种优势，如可以去掉大肠杆菌中间体的步骤以加快克隆宿主菌株的构建。荧光假单胞菌可使用电转化，转化步骤和其他革兰阴性细菌相似。另一个质粒pCN51是假单胞菌（Pseudomonas savastanoi）质粒pPS10和克隆载体pBR325的杂合体。通过卡那霉素抗性标记的选择，pCN51能够在大肠杆菌和荧光假单胞菌中复制。

为了达到消除抗生素和抗生素标记物的目的，进一步修饰这些质粒，已经开发出基于营养缺陷型标记互补的无抗生素选择系统：一种是基于pyrF互补，另一种是基于proC互补。从荧光假单胞菌基因组中敲除这些基因（pyrF和proC），分别产生尿嘧啶或脯氨酸营养缺陷型，然后将它们分别整合到表达质粒RSF1010和pCN51中。使用RSF1010和pCN51载体作为主干，结合在转录和翻译控制中涉及的各种元件，科研人员构建了多种表达载体以用于在荧光假单胞菌中表达蛋白质。例如，将大肠杆菌表达质粒pKK223-3（Pharmacia）中的启动子Ptac和转录终止子rrnT1T2克隆到衍生的RSF1010中，使之在荧光假单胞菌中调节重组表达。

Dow等开发了一种专用于生产重组蛋白的荧光假单胞菌表达系统。这个系统与大肠杆菌系统相比有几个显著的优点：①它与大肠杆菌一样具有表达重组蛋白的能力[总蛋白质含氮量为50%（质量分数）]和高细胞密度生长的能力（氮质量浓度为100g/L）；②荧光假单胞菌表达蛋白质依赖氧浓度程度低，而且在生产过程中没有醋酸盐积累，因此荧光假单胞菌的发酵工艺可以不需要严格控制氧浓度和/或葡萄糖的浓度。