杂交后应获取针对实验所用2种荧光染料的微阵列荧光图像，分别为红色及绿色，然后叠加图像获得芯片杂交综合图像数据，如图11-3所示。

图11-3　芯片扫描荧光叠加结果图

使用的装置是激光扫描共聚焦扫描仪，如图11-4所示。扫描仪有一个激光管或一组激光管，可以产生与所用荧光染料激发光谱相应的某一波长激光。激光穿过一标准物镜照亮玻片上的一个点，激发荧光被物镜聚集后又穿过一系列滤镜、一个校准透镜和一个极小孔眼以降低噪音，这使得它成为一个共聚焦装置，并在一个光电倍增管中进行计量。激光束快速扫描玻片后获得微阵列的一幅光栅图像。用一对galvanometer将光束定位于固定玻片上的各个点，或用泛光照射源和CCD镜头，也可获得相似图像。

图11-4　芯片扫描仪

为了避免信号值过低带来误差，只有那些Cy3或Cy5大于800的点被选出进行后续分析，并根据软件提供的校正系数对整张芯片的荧光信号值进行校正。对于芯片上各点都采用Cy5/Cy3的比值作为ratio值，ratio值大于2.0或者小于0.5的点被认为是有表达差异的基因，利用芯片上点的管家基因的信号强度值校正芯片之间的差异。使用各种统计软件进行聚类分析等。

图11-5所示为芯片扫描点阵分析图，图11-6所示为芯片扫描点状分析图。

图11-5　芯片扫描点阵分析图

图11-6　芯片扫描点状分析图(www.daowen.com)

【小结】

DNA芯片技术不断完善，使科学家可以从基因组水平对全体基因的表达谱进行分析，并进而探索转录因子的结合位点、研究基因组层面的DNA甲基化、组蛋白修饰等表观遗传学为新兴的表达调控方式提供了可能。本章介绍了基因芯片实验原理，步骤和方法，便于同学们了解较为前沿的芯片技术，也为芯片技术的应用奠定基础。

【巩固练习】

（1）基因芯片的原理是基于什么？

（2）基因芯片的种类及主要功能有哪些？

（3）举例说明基因芯片在临床诊断中得应用。

（4）芯片实验中存在的假阳性、假阴性的原因是什么？

（5）芯片实验中杂交温度和PCR实验中的退火温度有什么异同点？

【实验小故事】

程京教授从事医学生物物理研究30余年。1994年进入生物芯片这一工程、技术和生命科学交叉的新领域。1999年3月回国后在芯片设计原理、制作工艺、芯片实验室系统集成和配套仪器方面做了系统和深入的创新性研究，回国前，发明2项核酸萃取技术并参与开发出3个产品，由GE Healthcare等全球销售20余年。首次在国际上研究完成集血液中细菌分离、胞解及杂交检测为一体的芯片实验室系统，1998年该成果以“Lab on a Chip”为封面文章发表在Nature上，并被Science当年世界十大科技突破所引用。

程京教授建立了5类共性创新技术：① 基于标签技术的突变检测芯片技术。② 基于寡核苷酸芯片的蛋白活性检测技术。③ 检测小分子药物的蛋白芯片竞争免疫分析技术。④ 提高芯片检测精度和重复性的杂交盖片和特殊点样液技术。⑤ 无标记、实时、定量、高通量细胞芯片监测技术。基于这五类技术研制出面向临床和科研两大类生物芯片如下：建立了用于疾病预防、诊断及预后的快速、高通量分子分型芯片技术体系；研制出多项具有无标记、高通量检测特点的细胞芯片实验室系统。