（一）寡核苷酸芯片（Oligonucleotides Chip）

1. 概 念

寡核苷酸芯片是指固相载体上的寡核苷酸微阵列。其制备方法以直接在基片上进行原位合成为主、有时也可以预先合成，再按照制备cDNA芯片的方法固定在基片上。原位合成（In situ synthesis）是目前制造高密度寡核苷酸芯片最为成功的方法，有几种不同的工艺，其中最著名的是美国Affymetrix公司（http://www.affymetrix.com）的专利技术—— 光引导化学合成法（Light-directed chemical synthesis process）。产品名为GeneChip。

2. 寡核苷酸芯片的制备

Affymetrix公司已公开的光引导化学合成主要过程为：首先根据杂交目的确定寡核苷酸探针的长度和序列。再由计算机设计出合成寡核苷酸时用到的所有光掩膜（Masks）。最后做探针合成。光导原位合成技术的优点是可以用很少的步骤合成极其大量的探针阵列，探针阵列密度可高达到每平方厘米一百万个。

3. 寡核苷酸芯片的杂交和检测分析

样品处理和杂交检测方法与cDNA芯片是一致的。由于寡核苷酸阵列多需要区分单碱基突变．因此严格控制杂交液盐离子浓度、杂交温度和冲洗时间是杂交实验成败的关键。

（二）cDNA芯片（cDNA Chip）

1. 概 念

在玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等固相载体上固定的成千上万个cDNA分子组成cD4A微阵列。制作cDNA芯片最常用的固相载体是显微镜载玻片，载玻片在使用前需要进行表面处理，目的是抑制玻璃片表面对核酸分子的非特异性吸附作用。常用的表面处理方法有氨基化法、醛基化法和多聚赖氨酸包被法。

2. cDNA芯片的制备

制备cDNA芯片多用合成后点样法（Spotting after synthesis），简称点样法。合成后点样法使用的专用设备称为点样仪（Arrayer），目前有多家国外公司（如Bopdiscovery，Biorobotics，Vartesian Technologies，Genetic Microsystems，Genomicssolutions等）生产点样仪。点样仪的主要部件是由计算机系统控制的电脑机械手。点样时电脑机械手利用点样针头（Pin）从96或384檄孔板上蘸取cDNA样品，按照设计好的位置点在载玻片表面。针头的数目、机械手的移动时间、针头清洗和干燥时间、样品总数和载玻片数目共同决定了点样所需时间；针头的直径和形状、样品溶液的黏滞程度以及固相载体的表面特性决定了芯片上液滴的量和扩散面积。

除点样法以外，cDNA芯片也可以用电子定位法（Electronic addressing）制备。美国Nanogen公司最早使用这项技术，他们对空白片上的持定位点进行电活化，使相应活化点的表面带有电荷，成为“微电极”，能够吸附cDNA分子。带有微电极的片子与样品溶液共同孵育，溶液中的cDNA分子被吸附在微电极上，并与片子表面发生化学结合从而固定。用这种工艺制备的芯片的优点是：微电极的电吸附作用可以提高与靶核酸的杂交效率。缺点是制备复杂，成本较高。这种带有微电极的芯片也称为主动式芯片。许多公司出售商品化的cDNA芯片，可以根据需要从公司定制。(www.daowen.com)

3. cDNA芯片的使用方法—— 样品制备和杂交

（1）样品制备包括分离和标记两个方面，有些样品还经过核酸扩增放大这一步骤。样品制备的一般过程是：提取待检样品中的mRNA，反转录成cDNA，同时标记上荧光，荧光标记为最常用的方法，优点是无放射性且有多种颜色可供使用；研究者可以根据需要选用其他标记方法，例如同位素标记法、化学发光法或酶标法；如果目的是研究两种来源的组织细胞基因的差异表达，则分别提取两种组织细胞的mRNA，反转录成cDNA，分别标记两种不同颜色的荧光（如Cy3和Cy5），等量混合后与芯片进行杂交反应。

（2）杂交反应可以在专用的杂交仪（Hybridization station）或杂交盒（Hybridization chamber）内进行。杂交仪能够容纳多张芯片，有利于杂交过程的自动化和杂交条件的标准化。单个反应可以在杂交盒里进行，斯坦福大学Patrick O.Brown教授领导的实验室将制作杂交盒的详细说明提供在互联网，同时还提供了cDNA芯片设备、样品处理与杂交的完整的实验手册和有关软件的下载、网址是：http://cmgm.stanford.edu/pbrowri/index.html。

图11-1所示为芯片实验原理及基本步骤。

图11-1　芯片实验原理及基本步骤

4. 杂交信号检测和分析

通常检测芯片上的杂交信号需要高灵敏度的检测系统—— 阅读仪（Reader），阅读仪的成像原理分为激光共焦扫描和CCD成像两种。前者分辨率和灵敏度较高，但是扫描速度较慢且价格昂贵。后者的特点与之相反。一次标准的cDNA芯片杂交实验产生的成千上万个点的杂交信息，需要生物信息学手段的支持。已经有多种读取和分析杂交信号的应用软件以及能够与网络公共数据库连接进行数据分析的应用软件、在NHGRI的网站可以下载用于图像分析的软件，还可以找到能够与Genbank、Unigene等数据库联机工作的软件包。

基因芯片的主要类型及其简要特点见表11-1。

表11-1　基因芯片的主要类型及其简要特点