实验10-2　双向电泳

（一）样品制备

样品制备是双向电泳中最关键的一步，将直接影响2-DE结果好坏。目前并没有一个通用的样品制备方法，尽管处理方法多种多样，但都遵循几个基本的原则：（1）尽可能地提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失；（2）减少对蛋白质的人为修饰；（3）破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。

【实验材料】

细胞样品。

【实验操作】

（1）胰酶消化贴壁细胞，PBS漂洗3次（1 500 g，5 min），弃上清，再次离心，去尽残液。如要比较细胞膜蛋白组的差别，最好用细胞刮收获细胞。如用10mmol/L Tris/250 mmol/L Sucrose（pH 7.0）代替PBS，可有效降低样品的盐浓度。

（2）加入5倍体积裂解液，混匀（或将1×106细胞悬于60～100μL裂解液中）。

（3）加50 μg/mL RNase及200 μg/mL Dnase，在4 °C放置15 min。

（4）以15 000 r/min在4 °C离心60 min（或以40 000 r/min在4 °C离心30 min）。

（5）收集上清。

（6）测定蛋白浓度（采用BioRad RC/DC protein assay kit）。

（7）分装样品，冻存于-70 °C。

【实验材料】

组织样品。

【实验操作】

（1）将适量粉末状组织转移至匀浆器，加入适量裂解液，进行匀浆。

（2）加50 μg/mL RNase及200 μg/mL DNase，在4 °C放置15 min。

（3）15 000 r/min在4 °C离心60min（或以40 000 r/min在4 °C离心30 min）。

（4）收集上清，测定蛋白浓度。

（5）分装样品，冻存于-70 °C。

注意事项：

（1）8 mmol/L PMSF必须在添加还原剂之前用，否则PMSF会失去活性。

（2）40 mmol/L浓度以下的Tris可使有些蛋白酶在高pH下失活。

（3）细胞清洗：大多用PBS，若PBS残留于细胞表面会造成胶上出现水平条纹，则可利用10 mmol/L Tris，250 mmol/L sucrose pH 7.0来解决。

（二）样品上样

【实验操作】

（1）从冰箱中取出IPG胶条，室温放置10 min。

（2）沿水化盘槽的边缘从左向右线性加入样品，槽两端各1 cm左右不加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡，否则会影响胶条中蛋白质的分布。

（3）用镊子轻轻撕去IPG胶条上的保护层。注意：碱性端较脆弱，应小心操作。

（4）将IPG胶条胶面朝下轻轻置于水化盘中样品溶液上。注意：不要将样品溶液弄到胶条背面，因为这些溶液不会被胶条吸收；还使胶条下面的溶液产生气泡。若产生了气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶走。

（5）放置30～45 min大部分样品被胶条吸收，沿着胶条缓慢加入矿物油，每根胶条约3 mL（17 cm IPG），防止胶条水化过程中液体蒸发。

（6）置等电聚焦仪于-20 °C中水化11～15 h。

（三）第一向等电聚焦

【实验操作】

（1）将纸电极置于聚焦盘的正负极上，加ddH2O 5～8 μL润湿。

（2）取出水化好的胶条，提起一端将矿物油沥干，胶面朝下，将其置于刚好润湿的滤纸片上杂交以去除表面上的不溶物。

（3）将IPG胶条胶面朝下置于聚焦盘中，胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极，确保胶条与电极紧密接触。

（4）在每根胶条上覆盖2～3 mL矿物油。

（5）对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。

（6）聚焦结束的胶条，立即进行平衡、第二向SDS-PAGE电泳。或将胶条置于样品水化盘中，-20 °C冰箱保存，电泳前取出胶条，室温放置10 min，使其溶解。

（四）SDS-PAGE电泳

【实验操作】

（1）配制12%的丙烯酰胺凝胶。

（2）待凝胶凝固后，倒去分离胶表面的MilliQ水、乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ水冲洗。

（3）配制胶条平衡缓冲液Ⅰ。

（4）在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品，这样可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。

（5）将胶条转移至样品水化盘中，加入6 mL（17 cm IPG）平衡缓冲液Ⅰ，在水平摇床上缓慢摇晃15 min。

（6）配制胶条平衡缓冲液Ⅱ。

（7）第一次平衡结束后，取出胶条将之竖在滤纸上沥去多余的液体，放入平衡缓冲液Ⅱ中，继续在水平摇床上缓慢摇晃15 min。

（8）用滤纸吸去SDS-PAGE胶上方玻璃板间多余的液体，将二向凝胶放在桌面上，凝胶的顶部面对自己。

（9）将琼脂糖封胶液加热溶解。

（10）在100 mL量筒中加入TGS电泳缓冲液。

（11）第二次平衡结束后，取出胶条，用滤纸吸去多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。(www.daowen.com)

（12）用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸没在1×电泳缓冲液中漂洗数次。

（13）将胶条背面朝向玻璃板，轻轻放在长玻板上，加入低熔点琼脂糖封胶液。

（14）用适当厚度的胶片，轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触。

注意：不要在胶条下方产生气泡，应推动凝胶背面的支撑膜，不要碰到胶面。

（15）放置5 min，使低熔点琼脂糖封胶液凝固。

（16）打开二向电泳制冷仪，调温度为15 °C。

（17）将凝胶转移至电泳槽中，加入电泳缓冲液，接通电源，起始时用的低电流（5～10 mA/gel/17 cm），待样品在完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流（20～30 mA/gel/17 cm）待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。

（18）电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，并切角以作记号（戴手套，防止污染胶面）。

（19）进行染色。

（五）SDS-PAGE胶染色

表10-1　各种蛋白染色方法的灵敏度比较

1. 考马斯亮蓝染色

【实验材料】

（1）CBB染色液。

（2）0.5%考马斯亮蓝G250或R250。

（3）40%甲醇。

（4）10%乙酸。

（5）脱色液：30%甲醇+10%乙酸。

【实验步骤】

（1）在摇床上染色30 min。

（2）脱色至蛋白点或条带清晰可见。

（3）ddH2O洗3～5次。

2. 胶体考马氏亮蓝染色

【实验步骤】

（1）固定：甲醇/醋酸/H2O（45∶1∶54）至少20 min。

（2）染色12～18 h。染色液：17%（W/V）硫酸铵；34%甲醇；0.5%醋酸；0.1%（W/V）Coomassie G250。

（3）脱色：用H2O脱色至蛋白点和背景清晰。

（六）双向电泳蛋白点的切取和保存

【实验步骤】

（1）用PDQuest软件或肉眼比对，找出感兴趣的蛋白点，并做好标记和记录。

（2）用MilliQ水冲洗胶2次。

（3）用色谱纯甲醇和MilliQ水冲洗Ep管。

（4） 将枪头（200 μL）下端剪去，使其内径略小于蛋白斑点的直径，用色谱纯甲醇和MilliQ水冲洗枪头。

（5）对准斑点中央小心将蛋白切割下来，放入Ep管，MilliQ水漂洗2次，如胶块太大，将其切成1 mm×1 mm的胶片。

（6）将切好的点做好标记和记录，置-80 °C保存或冻干后置-20 °C存放。

【注意事项】

（1）尽量避免皮肤和头发的角蛋白的污染，在操作过程中应戴一次性的PE手套（不用乳胶手套）和帽子。

（2）不要将胶长期存放于乙酸溶液中。

（3）Ep管及染胶的容器必须用甲醇和水充分清洗，尤其应与进行Western blotting的容器分开，以避免casein或BSA的污染。

（七）考染SDS-PAGE条带酶解，提肽

【实验步骤】

（1）切胶前用ddH2O洗胶2～3次，以除去残留的乙酸和乙醇。

（2）用塑料切胶片将胶切成1 mm3大小的胶粒，盛于0.6 mL EP管中。

（3）脱色：加入100 μL（对于小胶的一条带）50%ACN/50%50mmol/L NH4HCO3（即1/2的ACN与1/2的100 mmol/L NH4HCO3的混合液），漩涡混合仪上混旋10～30 min（根据脱色情况，可延长时间至30～45 min），去掉上清，重复1～2次，直到完全脱色（实在脱不掉，有时也不影响下游的酶解和质谱）。

（4）干胶：加100 μL ACN混匀，室温下放置5～10 min，可见胶粒变白，吸去ACN；重复1～2次，于37 °C置10～20 min，残留的ACN挥发尽。

（5）加酶：胰酶用0.1%的乙酸配成100 ng/μL的储存液。使用时，用40 mmol/L NH4HCO3 /10%ACN稀释成12.5 ng/μL的使用液。每管加12.5 ng/μL的胰酶10～15 μL（根据情况定量，酶液没过胶粒即可），将胶粒没过。4°C放15min，取出，吸去多余的胰酶，加入15 μL的40 mmol/L NH4HCO3/10%ACN（也可用ddH2O）覆盖，防止蒸发。

（6）酶解：37 °C，酶解过夜（一般16 h，3～6 h即可）。

（7） 提肽：将酶液转移到新的0.6 mL EP管中，胶粒中加入50～80 μL 50%ACN/5%TFA，超声（放冰袋）10～15 min，离心，上清合并；再加入20～50 μL 50%ACN/5%TFA，重复1～2次，上清合并。

（8）封上parafilm 膜，扎孔，-80 °C冷冻上清，进行冻干。

（9）冻干后的样品如不立即用，于-80°C保存。

（10）若做MALDI-MS，溶于1～3 μL样品准备液（50%ACN/0.1%甲酸），做靶鉴定；若做LC-MS，溶于15～25 μL 样品准备液（50%ACN），质谱鉴定