理论教育 生物化学与分子生物学实验:质谱技术相关

生物化学与分子生物学实验:质谱技术相关

时间:2023-11-18 理论教育 版权反馈
【摘要】:质谱已成为连接蛋白质与基因的重要技术,开启了大规模自动化的蛋白质鉴定之门。在MALDI-TOF中,最重要的进步是离子反射器和延迟提取,可达相当精确的分子量。在ESI-MS中,纳米级电雾源的出现使得微升级的样品在30~40 min内分析成为可能。Latter首次表明氨基酸组分的数据能用于从2-DE凝胶上鉴定蛋白质。

生物化学与分子生物学实验:质谱技术相关

质谱已成为连接蛋白质与基因的重要技术,开启了大规模自动化的蛋白质鉴定之门。用来分析蛋白质或多肽的质谱有两个主要的部分:样品入机的离子源;测量被介入离子的分子量的装置。

基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)为一脉冲式的离子化技术。它从固相标本中产生离子,并在飞行管中测其分子量。其次是电喷雾质谱(ESI-MS),是一连续离子化的方法,从液相中产生离子,联合四极质谱或在飞行时间检测器中测其分子量。在MALDI-TOF中,最重要的进步是离子反射器(Ion reflectron)和延迟提取(Delayed ion extraction),可达相当精确的分子量。在ESI-MS中,纳米级电雾源(Nano-electrospray source)的出现使得微升级的样品在30~40 min内分析成为可能。

以肽质指纹术和肽片段的测序来说明怎样通过质谱来鉴定蛋白质:

1. 肽质指纹术(Peptide mass fingerprint,PMF)

Henzel等人于1993年提出肽质指纹术,用酶(最常用的是胰酶)对由2-DE分离的蛋白在胶上或在膜上于精氨酸或赖氨酸的C-末端处进行断裂,断裂所产生的精确的分子量通过质谱来测量(MALDI-TOF-MS,或为ESI-MS),这一技术能够完成的肽质量可精确到0.1个分子量单位。所有的肽质量最后与数据库中理论肽质量相配比(理论肽是由实验所用的酶来“断裂”蛋白所产生的)。配比的结果是按照数据库中肽片段与未知蛋白共有的肽片段数目作一排行榜,“冠军”肽片段可能代表一个未知蛋白。若冠亚军之间的肽片段存在较大差异,且这个蛋白可与实验所示的肽片段覆盖良好,则说明正确鉴定的可能性较大。(www.daowen.com)

2. 肽片段(Peptide fragment)的部分测序

肽质指纹术对其自身而言,不能揭示所衍生的肽片段或蛋白质。为进一步鉴定蛋白质,出现了一系列的质谱方法用来描述肽片段。用酶或化学方法从 N- 或 C- 末端按顺序除去氨基酸,形成梯形肽片段(Ladder peptide)。首先以一种可控制的化学模式从N-末端降解,可产生大小不同的一系列的梯形肽片段,所得一定数目的肽质量由MALDI-TOF-MS测量。另一种方法涉及羧基肽酶的应用,从C-末端除去不同数目的氨基酸形成肽片段。化学法和酶法可产生相对较长的序列,其分子量精确至以区别赖氨酸和谷氨酰胺。在质谱仪内应用源后衰变(Post-source decay,PSD)和碰撞诱导解离(Collision-induced dissociation,CID),目的是产生包含有仅异于一个氨基酸残基质量的一系列肽峰的质谱,从而允许推断肽片段序列。由CID图谱还可获得的几个序列的残基,叫作“肽序列标签”。这样,联合肽片段母离子的分子量和肽片段距N、C的距离将足以鉴定一个蛋白质。

3. 氨基酸组分分析

利用蛋白质异质性的氨基酸组分特征,成为一种独立于序列的属性,不同于肽质量或序列标签。Latter首次表明氨基酸组分的数据能用于从2-DE凝胶上鉴定蛋白质。通过放射标记的氨基酸来测定蛋白质的组分,或者将蛋白质印迹到PVDF膜上,在155 °C进行酸性水解1 h,通过这一简单步骤的氨基酸的提取,每一样品的氨基酸在40 min内自动衍生并由色谱分离,常规分析为100个蛋白质/周。依据代表两组分间数目差异的分数,对数据库中的蛋白质进行排榜,“冠军”蛋白质具有与未知蛋白质最相近的组分,考虑冠亚军蛋白质分数之间的差异,仅处于冠军的蛋白质的可信度大。Internet上存在多个程序可用于氨基酸组分分析,如AACompIdent,ASA,FINDER,AAC-PI,PROP-SEARCH等,其中,在PROP-SEARCH中组分、序列和氨基酸的位置被用来检索同源蛋白质。但仍存在一些缺点,如由于不足的酸性水解或者部分降解会产生氨基酸的变异,应联合其他的蛋白质属性进行鉴定。

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