【实验目的】

（1）掌握蓝白筛选原理。

（2）熟悉乳糖操纵子的原。

（3）了解假阴阳性结果分析。

【实验原理】

重组子筛选是指将重组产生的不同于亲本基因型的个体或组织，即重组子，通过转化、转染等方式导入受体细胞，经过培养得到大量所需转化子菌落或转染噬菌斑，进而将重组体的转化子细胞或转染噬菌体从其他细胞群体中分离出来，鉴定该无性繁殖的外源基因确实为目的基因的过程。可用的方法有载体表型选择法，如抗药性标记及其插入失活选择法和半乳糖苷酶显色反应选择法。

抗生素筛选法：菌株为某种抗生缺陷型，而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素，卡拉霉素等）。这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。本实验利用抗生筛选转化子。半乳糖苷酶显色反应选择（互补法）：现在使用的许多载体（如PUC系列）含有一个大肠杆菌DNA的短区段，其中含有β-半乳糖苷酸基因（lacZ）的调控序列和头146个氨基酸编码区。这个编码区中插入一个多克隆位点。受体菌则含编码β-半乳糖苷酶C端aa的序列。当外源基因插入时，二者融为一体后，有ββatieb-半乳糖苷酶表达，在生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（x-gal）培养基中形成蓝色菌落。而当有外源基因插入到多克隆原点，从而造成插入失活，而使lacZ基因不表达而形成白色菌斑。通过颜色不同而区分重组子和非重组子。

除了根据插入基因特定条件下表达产物特性直接选择外，还有DNA电泳检测法，包括直接电泳检测法、酶切电泳检测法和PCR扩增检测法；核酸杂交检测法和免疫化学检测法如放射性抗体检测法、免疫沉淀检测法、酶联免疫吸附测定（ELISA）和蛋白质印迹法。

【实验试剂与器材】

1. 实验材料

载体质粒DNA为pBS；转化受体菌为E. coli DH5α菌株。

2. 实验试剂

X-gal（5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）和IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）而非直接使用β-半乳糖。X-gal以及β-半乳糖均为β-半乳糖苷酶底物，但是X-gal不能诱导β-半乳糖苷酶操纵子。

【实验步骤】

（1）每组连接反应转化原液取100 μL用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上，37 °C下培养0.5 h以上，直至液体被完全吸收。

（2）倒置平板于37 °C继续培养12～16 h，待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。

（3）放于4 °C 数小时，使显色完全（此步LB培养基不做）。不带有T-vector DNA的细胞，由于无Amp抗性，不能在含有Amp的筛选培养基上成活。带有T-vector的空载体的转化子由于具有β-半乳糖苷酶活性，在X-gal和ITPG培养基上为蓝色菌落；带有重组质粒转化子由于丧失了β-半乳糖苷酶活性，在X-gal和ITPG培养基上为白色菌落。

（4）酶切鉴定重组质粒：用无菌牙签挑取白色单菌落接种于含Amp 50 μg/mL的5mL LB液体培养基中，37 °C下振荡培养12 h。使用煮沸法快速分离质粒DNA直接电泳，同时以煮沸法抽提的T-vector做对照，有插入片段的重组质粒电泳时迁移率较T-vector慢。再用与连接末端相对应的限制性内切酶进一步进行酶切检验。还可用杂交法筛选重组质粒。

【注意事项】

（1）质粒的质量和浓度：用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA（cccDNA）。转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，转化效率就会降低。一般情况下，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的10%。

（2）防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，tip头等最好是新的，并经高压灭菌处理，所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其他试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入，为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。(www.daowen.com)

（3）显色反应的时间：需要将平板放入4 °C冰箱中3～4 h，使得显色反应充分。

（4）平板的涂布：用菌液涂平板时要避免来回涂布，否则过多的机械挤压涂布会导致细胞破裂，影响转化效率。

【讨论与思考】

（1）重组子的筛选方法有哪些？

（2）如何最终确认重组子？

【小结】

分子生物学实验是以分子生物学理论为指导，以基因工程技术流程为主线，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。总体概括地说，基因工程的基本技术路线是：分（利用PCR技术进行目的基因的分离及扩增）、切（利用限制性内切酶对目的基因及表达载体进行酶切反应）、接（目的基因和载体经双酶切后，DNA连接酶连接）、转（感受态细胞的制备及重组DNA分子导入受体细胞的）、筛（重组子的筛选）。

【巩固练习】

（1）什么是质粒？质粒作为载体的结构要素是什么？

（2）简述蓝白斑筛选的实验原理。

（3）基因工程的技术路线是什么？

（4）高保真DNA聚合酶有哪些特点？

（5）简述荧光定量PCR的工作原理。

【科研小故事】

人类基因组计划于1990年启动，旨在揭开人体30亿个碱基对的秘密，绘制人类基因组序列图，从而在分子层面上为人类提供一份生命“说明书”，有人将其称为生命科学的“登月计划。2003年4月14日，中、美、日、德、法、英6国科学家宣布，人类基因组序列图绘制成功，人类基因组计划的所有目标全部实现。

人类基因组含有四万到十万个基因，由约三十亿个碱基对组成，分布在细胞核的二十三对染色体中。为破译这本蕴藏着生命奥秘、决定人生老病死的“天书”，1999年9月，中国积极加入这一研究计划，负责测定人类基因组全部序列的百分之一，也就是3号染色体上的三千万个碱基对，中国因此成为参与这一研究计划的唯一发展中国家。

这一项目主要由科技部、中科院以及国家自然科学基金委员会联合资助，由中科院基因组信息学中心、国家人类基因组南方中心、国家人类基因组北方中心的科学家共同承担。为完成工作，中国科学家付出了艰辛的努力，首先他们对被国际同行称为“北京区域”的这一部分进行了详细分析，1999年10月1日大规模的基因测序正式开始。最终，科学家们共测定3.84亿个碱基，相当于将所负责区域重复测定12次以上，所有指标达到了“国际人类基因组计划”协作组对“完成图”的要求，国际人类基因组计划中国部分“完成图”提前两年绘制完成，所有数据递交到国际基因数据库中，可被全球科学家直接免费享用。

据悉，在参与这一计划的六个国家中，虽然参与时间最晚，但中国的基因组测序能力已经超过法国和德国，名列第四。中国在人类基因组计划中占据了1%的份额。“不要小看这1%它代表着中国科学家在这个划时代的里程碑上，已经刻上了中国人的名字。”人类基因组计划中国联系人、中国科学院遗传研究所人类基因组中心专家说。

另有专家认为，人类基因组计划中国部分的完成，必将大大促进中国生物信息学、生物功能基因组和蛋白质等生命科学前沿领域的发展，也将为中国基因资源开发利用，医药卫生农业等生物高技术产业的发展开辟更加广阔的前景。

同时，表明中国在基因组学研究领域已达到国际先进水平。中国参与国际人类基因组计划并作出重大贡献，充分显示了我国新一代领导人积极参与国际合作重大课题的创新思维与创新策略，显示了中国科学家在科学探索、科研体制方面的创新精神。中国的参与改变了人”，、类基因组研究的国际格局，提高了中国在国际社会的形象，受到了国际同行的欢迎与称颂。我国理所当然地分享国际人类基因组计划的全部成果与数据、资源与技术以及有关事务的发言权，形成了接近世界水平的基因组研究实力。