【实验目的】

（1）掌握感受态细胞制备及工作原理。

（2）熟悉感受态细胞制备实验操作。

（3）了解转化效率计算方法。

【实验原理】

所谓感受态即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。

大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法）。其原理是细菌处于0 °C，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42 °C短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。

Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106～2×107转化子/μg质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上，联合其他的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100～1 000倍。

【实验试剂与器材】

1. 实验材料

微生物菌株：大肠杆菌菌株，如DH5α，Top10，BL21 等。

2. 实验试剂

（1）100 mmol/L CaCl2溶液。

（2）30% 甘油。

3. 实验器材

恒温摇床、电热恒温培养箱、台式高速离心机、无菌工作台、低温冰箱、制冰机、分光光度计、微量移液枪。

【实验步骤】(www.daowen.com)

1. 感受态细胞的制备

（1）挑取一DH5α单菌落于2.5 mL LB培养液中37 °C过夜培养。

（2）取其中500 μL菌液于一含50 mL LB培养液的锥形瓶中，37 °C振摇培养至OD600值达到0.4～0.6。

（3）取2 mL菌液置于离心管内，冰浴10 min，在4 °C以4 500 r/min离心5min，将培养液倒掉，将管倒置1 min以便培养液流尽。

（4）加入2 mL，100 mmol/L的冰冷CaCl2溶液，摇荡重悬细胞，冰浴30 min。

（5）在4 °C以4 500 r/min离心5 min，收集细胞后，加0.4 mL、100mmol/L的冰冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置2～3 min，即成感受态细胞悬液。（注意：以上操作完成了新鲜感受态细胞的制备。）

2. 感受态细胞的分装与冻存

在2 mL制备好的感受态细胞中加入2 mL30%甘油（即1∶1体积，甘油终浓度15%），将此感受态细胞分装成每份200 μL（1.5 mL Eppendorf管），液氮速冻，快速转入-70°C冰箱保存。（如果没有液氮，可以将分装的感受态细胞直接转入-70°C冰箱保存。）

【注意事项】

（1）细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。

（2）所用的试剂，如CaCl2等均需是最高纯度的分析纯，并用超纯水配制，最好分装保存于干燥的冷暗处。

（3）防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行。

【讨论与思考】

（1）请阐述转化、转染和感染的概念、区别，并列举例子说明。

（2）若感受态效率低，分析有哪些方面的原因？

（3）比较常用的几种感受态制备方法，例如CaCl2法、甘油-聚乙二醇法、电击法等。